[發明專利]草酸青霉BAM-1及其分離純化方法與應用

有效

• 申請號: 201310497471.3
• 申請日: 2013-10-22
• 公開（公告）號: CN103525710A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 郭子武;陳雙林;李迎春;楊清平
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C09K17/00;C12R1/80;C09K101/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1，保藏號為CGMCC?No.8315。

2.如權利要求1所述的草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1，其特征在于其分離純化方法包括以下步驟：

1）富集培養：取土壤和腐爛有機覆蓋物樣品，在無菌水中振蕩分散后，取懸濁液接種于馬丁氏孟加拉紅富集培養基中，28?℃下120?r·min^-1振蕩培養2?d，反復培養3次；

2）初篩：取第三次富集培養液，用玻璃涂布棒均勻涂布在剛果紅纖維素平板培養基上，28?℃下培養，以在平板上出現透明水解圈的時間以及培養4-5?d后水解圈直徑與菌落直徑的比值大小為基準，篩選水解圈出現早且直徑較大的菌株，將篩選出的菌株保存在PDA平板培養基上；

3）復篩：將初篩獲得的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株在PDA培養基上活化后，用直徑1?cm打孔器在菌落生長均勻處取菌塊接種到赫奇遜液體復篩培養基中，28?℃下120?r·min^-1振蕩培養5?d，測定發酵液濾紙酶活力，篩選出酶活力最高的菌株，測序，該菌株的26S?rRNA基因序列如SEQ?ID?NO：1所示。

3.如權利要求2所述的草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1，其特征在于：步驟1）中所述的馬丁氏孟加拉紅富集培養基的配方為：KH₂PO₄?1?g、MgSO₄·7H₂O?0.5?g、蛋白胨5?g、葡萄糖10?g、瓊脂20?g、孟加拉紅3.3?mg、鏈霉素30?μg、H₂O?1000?ml、自然pH值。

4.如權利要求2所述的草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1，其特征在于：步驟2）中所述的剛果紅纖維素平板培養基配方為：CMC-Na?2.1?g、剛果紅0.39?g、(NH₄)SO₄?2.1?g、MgSO₄·7H₂O?0.5?g、K₂HPO₄?1.05?g、NaCl?0.5?g、瓊脂18?g、H₂O?1000?ml、自然pH值。

5.如權利要求2所述的草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1，其特征在于：步驟3）中所述的赫奇遜液體復篩培養基配方為：稻草25?g、KH₂PO₄?1.05?g、NaCl?0.11?g、MgSO₄·7H₂O?0.29?g、NaNO₃?2.51?g、FeCl₃?0.01?g、CaCl₂?0.10?g、H₂O?1000?ml、pH值6.05。

6.如權利要求1或2所述的草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1，其特征在于其活化方法如下：配制PDA固體培養基，高壓滅菌，冷卻至50?℃，倒平板，冷卻后用粘有菌株的接種環在平板培養基上劃線，用封口膜封好培養皿，倒置28?℃靜置培養3-5?d，可重復復壯1-2次，整個接種與培養過程在超凈工作臺中無菌條件下進行；所述的PDA固體培養基的制作方法為：1）取去皮馬鈴薯200?g，切碎，加入500?ml?蒸餾水煮沸15?min，過濾，得到馬鈴薯汁；2）在該馬鈴薯汁中加入葡萄糖20?g；3）然后加水至1000?ml，調節pH值至6.05，得到液體PDA液體培養基；4）向PDA液體培養基中加入18?g瓊脂，得到固體PDA培養基。