[發(fā)明專利]具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶及其制備方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310495948.4
• 申請(qǐng)日: 2013-10-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103525796A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡惜朝;葛忠平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇輝騰生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/84
• 分類號(hào): C12N9/84;C12N9/06;C12N15/70;C12P35/02
• 代理公司: 張家港市高松專利事務(wù)所(普通合伙) 32209
• 代理人: 孫高

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶及其制備方法和該重組酶在一步法制備7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)是目前廣泛使用的頭孢類抗生素藥物的半合成中間體和原料，在臨床醫(yī)藥的生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。7-ADCA主要有生物催化合成和化學(xué)合成兩種方法得到。化學(xué)合成法是從青霉素G經(jīng)過(guò)氧化、擴(kuò)環(huán)重排和水解幾步反應(yīng)得到，雖然原料價(jià)廉易得，但工藝復(fù)雜，使用大量有毒試劑，不僅導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性較低，成本較高，并且產(chǎn)生大量對(duì)環(huán)境嚴(yán)重危害的廢物。使用生物酶催化合成代替化學(xué)合成生產(chǎn)7-ADCA，具有工藝簡(jiǎn)單、高效、安全無(wú)污染及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，其研究一直受到產(chǎn)業(yè)界與學(xué)術(shù)界的共同重視。?

目前產(chǎn)業(yè)界使用的成本最低且較為成熟的生物酶法工藝是以發(fā)酵產(chǎn)物去乙酰氧基頭孢菌素C為原料，以D-氨基酸氧化酶(DAO)和戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶(GLA)為催化劑的兩步酶法。在DAO催化下去乙酰氧基頭孢菌素C被氧化脫氨，生成相應(yīng)的alfa-酮基-己二酰-7-ADCA和過(guò)氧化氫，然后在過(guò)氧化氫作用下氧化脫羧生成戊二酰-7-ADCA(GL-7-ADCA)，再經(jīng)GLA催化水解脫戊二酰基側(cè)鏈生成7-ADCA。該法為當(dāng)前生產(chǎn)7-ADCA的較為實(shí)用的酶催化?工藝路線，所使用的兩種生物酶DAO和GLA可以通過(guò)培育不同的菌種經(jīng)生物工程發(fā)酵得到，國(guó)外已經(jīng)通過(guò)適當(dāng)?shù)幕蛑亟M和蛋白質(zhì)工程手段得到較高活性單位的DAO和GAL，并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，國(guó)內(nèi)雖然已經(jīng)有相關(guān)的酶的研究和生產(chǎn)，但僅僅應(yīng)用在7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的制備上，對(duì)于7-ADCA其仍然面臨著活性較低、穩(wěn)定性較差導(dǎo)致的產(chǎn)品收率較低等問(wèn)題，另外，這種兩步酶法工藝需要對(duì)兩種菌株分別培養(yǎng)和表達(dá)，然后進(jìn)行酶的分離和純化，最后分兩步單元操作進(jìn)行酶催化反應(yīng)，過(guò)程中還需按照不同的條件進(jìn)行控制和監(jiān)測(cè)，所以開(kāi)發(fā)更經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的7-ADCA酶催化合成工藝和相關(guān)酶制劑已經(jīng)成為提高我國(guó)頭孢類藥物中間體生產(chǎn)工藝技術(shù)水平，促進(jìn)抗生素工業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)的現(xiàn)實(shí)需要。?

應(yīng)用分子生物學(xué)菌種培育和基因工程技術(shù)，開(kāi)發(fā)一種可以一步水解脫除去乙酰氧基頭孢菌素C(DAOC)的氨基酸側(cè)鏈的酶，是目前改進(jìn)7-ADCA酶法生產(chǎn)工藝的最佳手段和研發(fā)熱點(diǎn)。用DAOC酰化酶來(lái)直接催化水解D-alfa-氨基己二酸側(cè)鏈?zhǔn)欠椒ㄖ唬侥壳盀橹梗嚓P(guān)的DAOC酰化酶包括經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變和定向進(jìn)化等各種基因工程手段改進(jìn)的重組酶，其催化水解活力都仍然很低，遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)催化的需要。另一種方法是在同一反應(yīng)器中連續(xù)發(fā)生D-氨基酸氧化反應(yīng)和戊二酰水解反應(yīng)，一鍋法生產(chǎn)7-ADCA。目前在制備7-ACA過(guò)程中，有類似生產(chǎn)工藝的報(bào)道。包括分別加入產(chǎn)生DAO和GLA活性的酶或細(xì)胞進(jìn)行一鍋反應(yīng)，但因兩種酶的最適合條件不一致以及反應(yīng)體系中副產(chǎn)物過(guò)氧化氫的干擾，使酶的活性和穩(wěn)定性降低，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)化停滯和中間產(chǎn)物的積累。?

在成功克隆出DAO和GLA兩種酶對(duì)應(yīng)的基因并對(duì)其基因序列充分了解之后，構(gòu)建融合兩種基因序列的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒即可表達(dá)出具有雙酶活性的重組酶，即所謂的融合基因和融合蛋白，它是將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾相連，置于同一套調(diào)控序列控制之下構(gòu)成的嵌合基因，經(jīng)合適的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)?后，即可獲得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能酶。這種由基因工程手段得到的新酶可以對(duì)兩步甚至多步催化工藝進(jìn)行改進(jìn)，使之變得更為簡(jiǎn)單、高效。而且，只進(jìn)行單次發(fā)酵就可以得到實(shí)現(xiàn)兩種催化作用的DAO和GLA的融合蛋白酶，使用這種雙功能酶也可以使7-ADCA的兩步酶法工藝成功改造為一鍋單步反應(yīng)，使生物酶制備工藝和生物酶催化反應(yīng)工藝實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的升級(jí)換代。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性，且活性和穩(wěn)定性高的重組酶。?

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶，所述的重組酶的編碼基因，其基因序列與SEQ?ID?NO.2限定的基因序列具有90%以上同源性（包含相同基因序列），且編碼相同功能的蛋白質(zhì)；?

所述的具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶編碼基因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體的基因序列與SEQ?ID?NO.1具有90%以上同源性（包含相同基因序列），且編碼相同功能蛋白質(zhì)的基因序列。?