[發明專利]具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201310495948.4
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN103525796A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 胡惜朝;葛忠平
• 申請（專利權）人: 江蘇輝騰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N9/84
• 分類號: C12N9/84;C12N9/06;C12N15/70;C12P35/02
• 代理公司: 張家港市高松專利事務所(普通合伙) 32209
• 代理人: 孫高

1.一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶，其特征在于：所述的重組酶的編碼基因，其基因序列與SEQ?ID?NO.2限定的基因序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能的蛋白質。

2.根據權利要求1所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶，其特征在于：所述的重組酶編碼基因的表達載體基因序列與SEQ?ID?NO.1具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的基因序列。

3.權利要求1所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其步驟為：將戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶基因和D-氨基酸氧化酶基因分別置于各自啟動子的調控之下，構建雙基因共表達質粒，該雙基因共表達質粒經轉化入大腸桿菌，再經培養，得到同時表達具備戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活力的重組酶。

4.根據權利要求3所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于：所述的戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶基因序列與SEQ?ID?NO.4具有90%以上同源性，且編碼戊二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶活性的基因序列。

5.根據權利要求3所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于：所述的D-氨基酸氧化酶基因序列與SEQ?ID?NO.3具有90%以上同源性，且編碼D-氨基酸氧化酶活性的基因序列。

6.根據權利要求4、4或5所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于：所述的戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶共表達質粒，其共表達啟動子為T5。

7.根據權利要求3所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的制備方法，其特征在于：所述的大腸桿菌為大腸桿菌E.coli?BL21、大腸桿菌M15、大腸桿菌DH5a及大腸桿菌W3110中的一種。

8.權利要求1所述的一種具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶在7-氨基基去乙酰氧基頭孢烷酸制備中的應用：將具有戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸酰化酶和D-氨基酸氧化酶活性的重組酶的粗酶液，加入磷酸緩沖溶液中，再加入去乙酰氧基頭孢菌素C，在32±5℃溫度條件下攪拌反應，用堿液維持反應在pH=7.5±0.5，HPLC檢測反應進程，待體系pH值不再變化，停止反應，提純得7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸。