[發明專利]葉酸偶聯羧甲基殼聚糖納米粒作為光控釋放NO載體的制法

有效

• 申請號: 201310492713.X
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN103520720A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 萬錒俊;桂日軍
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: A61K41/00
• 分類號: A61K41/00;A61K47/36;A61P35/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

技術領域

本發明屬于化學、生物與材料的交叉領域，具體涉及一種葉酸偶聯羧甲基殼聚糖納米粒作為光控釋放NO載體的制法。

背基技術

一氧化氮(NO)可被人體內皮細胞合成，是一種重要的生理調節劑，廣泛分布于全身多種器官，亦被認為是重要的生物信使分子。NO能有效防止血小板凝結與活化，減少細菌粘附，并具有殺死癌細胞的功能。NO的缺乏會導致器官功能失調，引發高血壓、心臟病、呼吸系統疾病等。為治療因NO缺乏而引起的各種疾病，相關研究者設計并合成了多種NO供體，尤其是以偶氮二烯醇親核NO供體為代表，它們是近幾年發展起來的一種性能優良的NO供體，通常是將含有仲胺基團的親核化合物與NO氣體在一定壓力下反應制得，能夠在生理環境中自發釋放NO。鑒于此類NO供體制備條件苛刻(高壓)以及制備產物釋放NO難以控制(釋放條件與速率)等問題，在一定程度上抑制了它們的應用價值，發展一種更高效的NO供體，兼具制備方法簡單，產物穩定及NO釋放可控等優點，已成為當前NO供體相關領域重要的研究目標之一。

羧甲基殼聚糖(CMC)是殼聚糖經羧甲基化反應后生成的一種水溶性衍生物，性質穩定，生物相容性高，可降解性好且毒性小。它既含有堿性陽離子(-NH₃⁺)基團，又含有弱酸性陰離子(-COO^-)基團，是一種兩親性聚電解質，將CMC發展為納米粒藥物(如NO)載體將具有良好應用前景。納米粒藥物載體分為被動靶向和主動靶向，被動靶向是利用載體的親/疏水性、靜電吸附、載體尺寸/質量、pH值等理化因素易被位于肝、脾、肺及骨髓的單核、巨噬細胞系統攝取，增強抗腫瘤藥物對位于單核/巨噬細胞系統的腫瘤化療效果。相比而言，主動靶向的效果更顯著，它是通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，使藥物能準確送達腫瘤細胞中，實現惡性腫瘤細胞的靶向治療。由于葉酸受體在腫瘤細胞外膜過度表達，說明腫瘤細胞與葉酸(FA)之間存在密切關系，當FA通過側基連接于CMC羧基(CMC-FA)，其依然保持正常的受體親和力，可通過受體胞吞作用被內在化。葉酸受體在多種人體腫瘤細胞的過度表達為特效藥物對腫瘤的靶向提供了一種有效方式，葉酸受體介導的細胞攝粒過程，即為FA的選擇性主動靶向作用(K.Sumanta，et?a1.，J.?Mater.Sci.∶Mater.Med.，2010，21，1587)。

鐵/硫/亞硝酰基離子簇Roussin粗蘇打鹽陰離子Fe₄S₃(NO)₇^-(RBS，Na⁺鹽)可被用作NO前體，早期研究證實了RBS可在紫外/可見波長光照射下，在生物學相關濃度下產生NO釋放，但在暗室，水溶性RBS是穩定的(F.W.?Fliteny，et?al.，Br.J.Pharmacol.，1992，107，842；F.W.?Fliteny，et?al.，Br.J.?Pharmacol.，1996，117，1549)。因此，將RBS負載進入CMC-FA納米粒體系，可制得兼具生物相容、主動靶向及腫瘤細胞內光控釋放NO性質于一體的高質量納米粒藥物載體。

截至目前，有關CMC-FA納米粒藥物載體的制備方法已有中國專利報道，如錢秀珍等設計了一種葉酸-羧甲基殼聚糖修飾的pH敏感多柔比星和紫杉醇脂質體(公開號：CN102225051A和CN102488658A)，但尚未見基于CMC-FA納米粒負載RBS形成CMC-FA-RBS復合納米粒NO載體(即新型NO供體)，及基于CMC-FA納米粒的光控釋放NO體系制備的相關中國專利報道。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種方法簡單，快速、成本低的葉酸偶聯羧甲基殼聚糖納米粒作為光控釋放NO載體的制法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：一種葉酸偶聯羧甲基殼聚糖納米粒作為光控釋放NO載體的制法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

(1)稱取質均分子量400kDa，脫乙酰度90％，羧甲基度1.112的羧甲基殼聚糖粉末(CMC)溶于去離子水，用0.22μM濾紙過濾后制成CMC水溶液，向其中滴加NaOH溶液，調節pH值為堿性，在避光下加入葉酸(FA)，磁力攪拌均勻，升高至一定溫度下反應；

(2)將反應后產物冷卻至室溫，用凝膠柱分離，于某一波長處監測洗脫過程，收集洗脫時流出的第一波峰的溶液，然后將其冷凍干燥，得到葉酸偶聯的羧甲基殼聚糖(CMC-FA)偶聯物；