[發(fā)明專利]一種甘露聚糖酶及生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310490356.3
• 申請日: 2013-10-19
• 公開（公告）號: CN103540580A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李忠興;楊忠義
• 申請（專利權(quán)）人: 沅江浣溪沙酶技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N9/24;C12R1/125
• 代理公司: 益陽市銀城專利事務(wù)所 43107
• 代理人: 舒斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)，具體地說是一種甘露聚糖酶及生產(chǎn)方法。?

背景技術(shù)

甘露聚糖酶包括以下四種：（1）、甘露聚糖內(nèi)切-1，4-β-甘露糖苷酶（Mannan?endo-1，4-β-mannosidase），編號EC?3.2.1.78；（2）甘露聚糖-1，4-β-甘露二糖水解酶（Mannan?endo-1，4-β-mannobiohydrolase），編號EC?3.2.1.100【又稱外切-1，4-β-甘露二糖水解酶（Exo-1，4-β-mannobiohydrolase）】；（3）β-甘露糖苷酶（β-Mannosidase），編號EC?3.2.1.25；（4）甘露聚糖內(nèi)切-1，6-β-甘露糖苷酶（Mannan?endo-1，6-β-mannosidase），編號EC?3.2.1.101。?

早在上世紀初就有關(guān)于分解植物甘露聚糖的報道，近年來隨著人們對甘露聚糖酶用途的不斷發(fā)現(xiàn)，推動了甘露聚糖酶研究的發(fā)展，1958年Courtios第一次報道了產(chǎn)生甘露聚糖酶的真菌；1960年William和Doetsch道了產(chǎn)生甘露聚糖酶的細菌；1965年，Reese和Shibata提出了甘露聚糖酶的概念和定義；七十年代后，人們對甘露聚糖酶的基本性質(zhì)的研究取得了較大發(fā)展，九十年代人們將甘露聚糖酶應(yīng)用于飼料養(yǎng)殖行業(yè)，取得了很好的發(fā)展，隨著人們對自然界半纖維素資源的開發(fā)及對木聚糖酶研究的不斷深入，甘露聚糖酶已在飼料、食品、造紙、石油開采及生物研究技術(shù)等多方面得到了廣泛的應(yīng)用研究。但是，在造紙方面始終沒有工業(yè)化應(yīng)用，主要原因是造紙所需酶要求在較高pH條件下使用，且要求酶的熱穩(wěn)定性好，價格便宜，而市面上的甘露聚糖酶多數(shù)是酸性酶，作用pH一般在pH3.5～6.0，很難應(yīng)用于造紙領(lǐng)域。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種適應(yīng)于堿性環(huán)境、熱穩(wěn)定性好的甘露聚糖酶及生產(chǎn)方法。?

本發(fā)明酶活力測定方法為，利用0.05mol/L?pH6.0的十二水合磷酸氫二鈉和一水合檸檬酸緩沖液配制0.5%的槐豆膠溶液。在0.9ml該底物溶液中加入0.1ml適當稀釋的酶溶液，50℃準確計時反應(yīng)10min，在550nm測光吸收值。其酶活力定義為，在測定條件下每小時水解槐豆膠產(chǎn)生1mg還原糖（以甘露糖計）所需酶量定義為一個酶活力單位（u）。?

本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)其發(fā)明目的的，一種甘露聚糖酶的生產(chǎn)方法，它包括菌種培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵、酶液制備步驟，所述菌種即枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），實驗室編號為PARK9639，保藏號：CGMCC?NO：6226，其生物學特性為：革蘭氏染色陽性菌，產(chǎn)芽孢，菌體呈桿狀，單個細胞?0.7～0.8×2～3微米，周生鞭毛，能運動，以二分裂方式增殖；芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米橢圓位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大,在本發(fā)明所述培養(yǎng)基上菌落呈圓形，污白色、著色均勻，邊緣整齊，無光澤，黏稠。?

本發(fā)明的菌種是在中國寧夏采集，在菌種選育篩選過程中，篩選出一株實驗室編號為PARK9639的高產(chǎn)菌株，根據(jù)主要生理生化特征及16S?rRNA基因序列、gyrB基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），該菌種已于2012年06月15日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏（北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏號：CGMCC?NO：6226，并于同日提交了保藏存活證明。?

本發(fā)明所述的菌種培養(yǎng)為CGMCC?NO：6226菌種在如下配制的斜面上生長良好，斜面培養(yǎng)基配方為：1000mL蒸餾水中，加入牛肉膏3g～8g，酵母膏3g～8g?，蛋白胨8g～12g，葡萄糖3g～5g?，氯化鈉3g～5g，調(diào)pH值6.9～7.1，0.1MPa滅菌28分鐘～32分鐘，制成試管斜面，接種該菌種，34℃～36℃，培養(yǎng)20小時～24小時后，放入5℃冰箱中備用，或向菌斜面上注入已滅菌液體石蠟后保藏或以脫脂牛奶為載體冷凍干燥真空封口保藏。?