[發(fā)明專利]雞β-防御素9酵母工程菌制備及其表達方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310488740.X
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN103614380A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設計）人: 祁克宗;涂健;張永正;彭開松;周秀紅;汪雪雁;劉紅梅;張明;陳玎玎;付瑞燕;薛秀恒
• 申請（專利權）人: 安徽農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;C07K14/465;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務所 34116
• 代理人: 胡敏

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術及基因工程制藥技術領域，具體涉及一種雞β-防御素9酵母工程菌制備及其表達方法。?

背景技術

自20世紀50年代起，抗生素的亞治療劑量就被添加到飼料中來促進動物的生長。大量抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用，已經導致耐藥性細菌不斷出現，一些感染性病原體甚至嚴重威脅到人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。隨著人們關注度的不斷提高和抗藥性病原的傳播，歐洲已經開始禁止在動物飼料中使用抗生素來促進動物生長。因此，尋找一種天然的無污染的能夠替代抗生素的新型飼料添加劑迫在眉睫，它既擁有抗菌功能，又能促進動物生長，以降低飼養(yǎng)成本。?

防御素屬于抗菌肽家族的一個亞族，是廣泛分布于動植物界的一類富含半胱氨酸的陽離子小肽。防御素具有廣譜抗微生物活性，對細菌、真菌、螺旋體、病毒等均有抗性，且病源微生物不易產生耐藥性，是宿主抵抗外來致病性微生物侵襲的重要防線，同時由于其在動物體的多種不同組織器官中持續(xù)性表達，也被認為是動物先天性免疫系統(tǒng)的一部分，具有重要的生理學功能。其主要特征是6個半胱氨酸殘基形成的3對二硫鍵，成熟肽大約有38-42個氨基酸，分子質量約為3-4kDa。根據空間結構的不同，防御素可以分為3大類：α-防御素、β-防御素和θ-防御素。禽防御素屬于β-防御素類，3對二硫鍵分別為Cys-1～Cys-5、Cys-2～Cys-4和Cys-3～Cys-6配對連接形成，富含精?氨酸，具有親水性和親脂性、特征性β-片層結構。迄今為止，已在雞體內發(fā)現了14種β-防御素，這些雞防御素基因被分別命名為AvBD1～14。其中雞β-防御素9（AvBD9）廣泛分布于雞的各類器官組織中，尤其在粘液囊、食道、嗉囊、肝臟和胃等消化系統(tǒng)各器官組織中表達量較高。消化道為動物機體與食源性病原接觸部位，也是其侵入部位。AvBD9具有良好的生物安全性，且具有較強的抗菌活性，能夠抑制或者殺死病原菌，這對雞消化道健康，尤其對防止上消化道感染等機體局部防御和炎癥中起著重要作用。在畜禽生產中可用于防治疾病,促進動物健康養(yǎng)殖,具有潛在的應用和開發(fā)價值,而分子重組技術是蛋白類或肽類產品開發(fā)應用的有效途徑。?

巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）表達系統(tǒng)既具有原核表達系統(tǒng)的表達量高、可大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)點，又具有真核表達系統(tǒng)的蛋白翻譯后修飾、加工及折疊的優(yōu)勢，且外源基因的遺傳穩(wěn)定性較好，是目前廣泛應用的真核表達系統(tǒng)之一。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有很高的生物安全性，獲得包括美國FDA在內的廣泛認可。畢赤酵母自身分泌很少量的蛋白，易于異源蛋白的分離純化，且其分泌的蛋白存在翻譯后加工修飾，使之更接近于天然蛋白的構象和活性，因此更適合真核生物基因的表達。又因其表達水平穩(wěn)定、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)點，而成為目前最受歡迎的異源蛋白基因表達系統(tǒng)之一。醇氧化酶AOX1啟動子(pAOX1)是P.pastoris表達中應用較多的啟動子,其甲醇誘導性很強。但發(fā)酵過程中需要用有毒揮發(fā)性的甲醇作為誘導劑，需要碳源的轉換，因而操作不方便，且外源蛋白的生產周期較長。甘油醛-3-磷酸?脫氫酶啟動子（pGAP）是P.pastoris的組成型強啟動子,已用來表達許多異源蛋白，并獲得了與pAOX1相似的產量。此外，GAP啟動子有許多優(yōu)勢：重組菌發(fā)酵過程簡單，安全性高且不需要大量甲醇的儲存與運輸，更適合大規(guī)模發(fā)酵生產，具有連續(xù)培養(yǎng)的潛能，且降低了目的蛋白的生產成本。?

酵母單細胞蛋白作為飼料具有明顯的優(yōu)勢，如酵母干物質中蛋白質含量約50%-60%；酵母菌中含有豐富的酶類，含有β-葡聚糖（57.0%）、甘露聚糖（6.6%）、糖蛋白（22.0%）和幾丁質等活性成分；蛋白質中含有動物機體所必須的各種氨基酸，特別是植物飼料中缺乏的賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量較多，生物學價值大大優(yōu)于植物蛋白質，單細胞蛋白的消化率高達85％～90％；既對動物具有促生長作用，又可提高機體免疫，對動物而言，酵母飼料是一種理想的生物活性蛋白質飼料。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的AvBD9基因是一種將來源于雞的禽β-防御素9基因優(yōu)化處理后的基因，其優(yōu)化處理是根據畢赤酵母偏愛性密碼子進行，將酵母不常用的密碼子agg、cgt、ggg、ggc、gca等優(yōu)化為偏愛密碼子aga、ggt、gct等，利用DNASTAR軟件分析后得到的，并在其5′端添加Kex2酶切位點編碼序列AAAAGA，經過這一處理，可使目標基因在畢赤酵母中更好的進行表達，并分泌出更接近于天然結構的活性成熟肽。?