[發(fā)明專利]雞β-防御素9酵母工程菌制備及其表達方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310488740.X
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN103614380A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 祁克宗;涂健;張永正;彭開松;周秀紅;汪雪雁;劉紅梅;張明;陳玎玎;付瑞燕;薛秀恒
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;C07K14/465;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 安徽匯樸律師事務(wù)所 34116
• 代理人: 胡敏

1.一種優(yōu)化AvBD9基因，其特征在于，其基因序列如序列表所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的優(yōu)化AvBD9基因，其特征在于，所述優(yōu)化AvBD9基因是將AvBD9基因中的酵母不常用密碼子替換成其慣用密碼子設(shè)計基因序列，并將AvBD9基因在基因的5′端添加EcoRⅠ酶切位點和Kex2酶切位點編碼序列AAAAGA，在基因的3′端添加TAA位點和NotⅠ酶切位點所獲得的，優(yōu)化AvBD9基因的基因全長為157bp。

3.一種雞β-防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，包括步驟：

（1）優(yōu)化AvBD9基因獲得；

（2）雙酶切AvBD9基因與載體pGHKα，連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母GS115獲得重組酵母菌株。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞β-防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，雙酶切AvBD9基因與載體pGHKα使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRⅠ和NotⅠ。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞β-防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，將步驟（2）獲得的重組質(zhì)粒使用SacⅠ和BglⅡ分別酶切出去Amp抗性基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞β-防御素9畢赤酵母工程菌制備方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方式為電擊轉(zhuǎn)化。

7.一種雞β-防御素9畢赤酵母工程菌表達方法，其特征在于，將權(quán)利要求3所得的重組酵母菌株經(jīng)過篩選，發(fā)酵培養(yǎng)，離心所得上清液中即為雞β-防御素9。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雞β-防御素9畢赤酵母工程菌表達方法，其特征在于，所述篩選是經(jīng)MD平板初篩，挑取所述重組酵母菌株的單菌落，用酵母細胞裂解液裂解細胞獲得酵母基因組DNA，以其為模板，用引物pG1：5′-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3′和pG2：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′進行PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，并點接于含0.5mg/mL?G418的YPD平板上篩選高拷貝重組菌。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雞β-防御素9畢赤酵母工程菌表達方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)是挑取重組酵母菌株的單菌落接種于5mL?YPD液體培養(yǎng)基，30℃、200rpm過夜培養(yǎng)，而后轉(zhuǎn)接于50mL?MD液體培養(yǎng)基28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2天。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的雞β-防御素9畢赤酵母工程菌表達方法，其特征在于，所述MD培養(yǎng)基包括有1～3%wtD-葡萄糖、1.3～1.4%wtYNB、0.0003～0.0005‰wt生物素、0.1～0.3%wt碳酸鈣。