[發(fā)明專利]一種應(yīng)用重組畢赤酵母穩(wěn)定地生產(chǎn)豬α干擾素的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310488705.8
• 申請(qǐng)日: 2013-10-17
• 公開（公告）號(hào): CN104561199A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于瑞嵩;史仲平;李震;高敏杰;丁健;董世娟;朱于敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院;江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種應(yīng)用重組畢赤酵母穩(wěn)定地生產(chǎn)豬α干擾素的方法。

背景技術(shù)

豬α干擾素(porcine?interferon-α，pIFN-α)是一種具有廣闊應(yīng)用前景的獸藥[Chinsangaram?J等，J?Virol,2001,75(12):5498-5503]。利用重組畢赤酵母進(jìn)行發(fā)酵是生產(chǎn)豬α干擾素的主要手段，豬α干擾素可全部分泌于發(fā)酵液中。在完成重組菌的構(gòu)建以及搖瓶工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究重點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐規(guī)模發(fā)酵工藝的優(yōu)化上。

近年來，有關(guān)豬α干擾素誘導(dǎo)工藝的優(yōu)化研究顯示，豬α干擾素的高效誘導(dǎo)表達(dá)與能否獲取極高密度的重組畢赤酵母細(xì)胞直接相關(guān)。但是，即便在培養(yǎng)階段獲得濃度相同的高密度細(xì)胞、誘導(dǎo)階段的操作條件也完全相同，不同發(fā)酵批次下的豬α干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)水平有時(shí)卻存在很大差異、導(dǎo)致其發(fā)酵生產(chǎn)性能的不穩(wěn)定[Yu?RS等，Bioproc?Biosyst?Eng，2010,33:473-483]。在利用重組釀酒酵母和大腸桿菌生產(chǎn)目標(biāo)外源蛋白時(shí)，細(xì)胞高密度流加培養(yǎng)階段的末期，代謝副產(chǎn)物乙醇和乙酸大量積累、嚴(yán)重抑制目標(biāo)蛋白的表達(dá)是眾所周知的事實(shí)[Lin?KH等，Appl?Microbiol?Biotechnol,1989,32:313-316；Lin?KH等，J?Chem?Jpn,1991,17:680-685；Johnson?W等，Bioproc?Biosyst?Eng,2002,25(2):111-120；Akesson?A等，Biotechnol?Bioeng,2001,73(3):223-230]。在豬α干擾素發(fā)酵生產(chǎn)的流加培養(yǎng)期，一般使用DO-Stat法自動(dòng)流加甘油、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。但是到了培養(yǎng)末期，細(xì)胞量達(dá)到極高密度(120～150g-DCW/L)后，由于耗氧量激增，使用DO-Stat法流加甘油會(huì)使培養(yǎng)液中的溶解氧濃度(DO)的基線水平(DO控制下限)瞬間或在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間(10～20min)內(nèi)處于接近于0的水平。這樣，畢赤酵母培養(yǎng)不斷地在好氧與厭氧狀態(tài)間來回切換，極易引起厭氧代謝副產(chǎn)物的生成與積累，最終嚴(yán)重影響到豬α干擾素的正常誘導(dǎo)表達(dá)和發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

至今，有關(guān)畢赤酵母高密度培養(yǎng)期內(nèi)代謝副產(chǎn)物的生成積累及其對(duì)誘導(dǎo)期內(nèi)目標(biāo)蛋白表達(dá)影響的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用重組畢赤酵母穩(wěn)定地生產(chǎn)豬α干擾素的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)豬α干擾素的方法，所述的重組畢赤酵母含有豬α干擾素表達(dá)盒，所述方法包括：

(1)將重組畢赤酵母在以甘油為碳源的初始培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)溶解氧濃度快速上升時(shí)，啟動(dòng)甘油流加；維持培養(yǎng)過程中乙醇濃度低于2g/L；當(dāng)酵母細(xì)胞達(dá)到高密度時(shí)，停止流加甘油，饑餓培養(yǎng)酵母細(xì)胞至碳源耗盡，啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)；

(2)在發(fā)酵液中流加甲醇和山梨醇，使甲醇濃度控制在5±1g/L，誘導(dǎo)表達(dá)豬α干擾素。

在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(1)中，當(dāng)初始培養(yǎng)基中甘油耗盡時(shí)，啟動(dòng)改良型DO-Stat控制程序流加甘油培養(yǎng)基，包括：預(yù)先設(shè)定乙醇濃度的控制水平≤2g/L，當(dāng)乙醇濃度超過該設(shè)定值，適度減小甘油流加的延遲時(shí)間；而當(dāng)乙醇濃度低于該設(shè)定值時(shí)，適度增大甘油流加的延遲時(shí)間，以保證細(xì)胞的高速生長(zhǎng)。

在另一優(yōu)選例中，按照下列公式調(diào)節(jié)甘油流加延遲時(shí)間：