[發(fā)明專利]一種重組大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201310488514.1
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN104560843A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設計）人: 劉立棟
• 申請（專利權）人: 常州邱鴻生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域：

本發(fā)明屬于微生物基因工程領域，具體地說將參與2，3-丁二醇生物合成的三個基因克隆并與大腸桿菌高拷貝載體pUC19連接，將重組質(zhì)粒轉入大腸桿菌中，使用氨芐青霉素作為篩選標記，以加強這三個基因在大腸桿菌中的表達量，使2，3-丁二醇可以在大腸桿菌中大量合成。?

背景技術：

2，3-丁二醇是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、食品、燃料及航空航天等領域，可以用于生產(chǎn)塑膠，制備防凍劑，并且是一種很好的溶劑，易于轉化為各種化合物生產(chǎn)橡膠，調(diào)味品以及化妝品(Syu?M?J.2001)。常溫下是一種無色無味的透明液體，相對分子量為90.12g/mol，其分子式如下所示。上世紀中期，2，3-丁二醇的生物技術生產(chǎn)得到了迅速的發(fā)展，由于更為廉價的化學合成法的出現(xiàn)，使得生物技術生產(chǎn)2，3-丁二醇陷入困境。但是化學合成法使用石油作為原料生產(chǎn)2，3-丁二醇。最近二十年來，上升的石油價格導致化學合成法失去了優(yōu)勢，在能源需求不斷擴大、化石能源日益短缺、石油資源供應不穩(wěn)定的情況下，以可再生的生物質(zhì)資源為原料，經(jīng)過生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)各種化學品、功能材料和能源物質(zhì)的生物技術方法獲得了人們的青睞。目前，研究熱點都在于以糖質(zhì)作為原料生產(chǎn)2，3-丁二醇，但是，糧食資源日益緊張的今天，開發(fā)以廉價的非糧糖質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇具有很好的發(fā)展前景.(Xiu?and?Zeng2008)?

自然界很多微生物都可以生產(chǎn)2，3-丁二醇，目前用來發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的微生物主要為細菌類，包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)等(Garg?S?K.1995，Celinska?E.2009，Soltys?K?A.2001)，其中克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬研究最為廣泛。這些細菌利用碳源的種類、發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的產(chǎn)量、生成的2，3-丁二醇異構體均有差異，如克雷伯氏菌產(chǎn)生的meso-2,3-丁二醇占86％～95％，L-(+)-2，3-丁二醇占5％～14％，而Bacilluspolymyxa產(chǎn)生的D-(-)-2，3-丁二醇占98％以上，因此是研究制備手性2，3-丁二醇的熱門菌株之一(De?Mas?C.1988)。此外，芽孢桿菌屬具有產(chǎn)生淀粉酶和木聚糖酶的能力，可以直接利用淀粉類物質(zhì)為底物，但其代謝產(chǎn)生副產(chǎn)物量較大，克雷伯氏菌雖然缺乏直接糖化淀粉的能力，但其底物使用范圍較寬，如葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、某些特定的二糖、糖醛酸等均可作為碳源，發(fā)酵較完全，對底物利用率高，且副產(chǎn)物較少，2，3-丁二醇產(chǎn)量較高，具有工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。但是由于糧食的短缺，導致以糖為底物的發(fā)酵生產(chǎn)前景堪憂，因此，我們使用了可以利用甘油的大腸桿菌作為生產(chǎn)菌株。大腸桿菌具有生物量較大，發(fā)酵周期短，生物背景明確，可以利用甘油這一非糖質(zhì)底物等優(yōu)點。由于現(xiàn)代工業(yè)在通過植物油和動物脂肪生產(chǎn)石油的過程中產(chǎn)生大量的廢棄甘油，這些廢棄甘油的比重高達10％，因此，使用大腸桿菌以甘油為底物生產(chǎn)2，3-丁二醇可以使原料成本降低，并且可以保護環(huán)境。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是獲得一種使用甘油為底物高產(chǎn)2，3-丁二醇的大腸桿菌菌株的制備方法。本發(fā)明的另一目的是公開了高產(chǎn)2，3-丁二醇的基因工程菌的發(fā)酵方法。?

本發(fā)明以大腸桿菌BW25141(美國E.coli?Genetic?Resources?at?Yale，The?Coli?Genetic?Stock?Center)為出發(fā)菌株，將三個與合成2，3-丁二醇有關的基因通過大腸桿菌高拷貝載體pUC19(美國New?England?BioLabs公司)轉入大腸桿菌中，從而獲得高產(chǎn)2，3-丁二醇的基因工程菌BDO16156。得到的菌株可以用甘油作為碳源生產(chǎn)2，3-丁二醇。?

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案達到的：?

一種使用甘油為底物高產(chǎn)2，3-丁二醇的大腸桿菌菌株的制備方法，其步驟如下：?

1)基因片段的克隆?

利用引物序列1?

GGGAAAGGTACCatgGACAAACAGTATCCGGTACGCC?

引物序列2?

GGGAAAGCATGCttaCAGAATCTGACTCAGATGCAGC?

PCR擴增基因片段alsS?

atgGACAAAC?AGTATCCGGT?ACGCCAGTGG?GCGCACGGCG?CCGATCTCGT?CGTCAGTCAG?