[發明專利]一種重組大腸桿菌利用甘油生產2,3-丁二醇的方法

在審

• 申請號: 201310488514.1
• 申請日: 2013-10-18
• 公開（公告）號: CN104560843A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 劉立棟
• 申請（專利權）人: 常州邱鴻生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一株可利用甘油生產2,3-丁二醇的大腸桿菌BW25141，質粒pBDO，基因工程菌BDO16156和2,3-丁二醇合成相關酶的基因alsS，alsD和bdh。

2.根據權利要求1中，利用甘油發酵生產大腸桿菌的方法，包括培養所需條件和培養基配方。

3.根據權利要求1中利用甘油發酵生產2,3-丁二醇的大腸桿菌基因工程菌的制備方法，包括：

a.利用設計的引物擴增得到三個相關合成酶的基因片段

b.利用熱擊法將構建質粒轉化入大腸桿菌的方法

c.用氨芐青霉素篩選陽性克隆并用于生產的方法。

4.根據權利要求1中三個2,3-丁二醇合成酶的相關基因設計的引物為：引物序列1，2，3，4，5，6

5.根據權利要求1中利用基因工程菌生產2,3-丁二醇的發酵方法及培養基：

LB培養基(1L)：Tryptone(胰蛋白胨)：10g，Yeast?Extract(酵母提取物)：5g，NaCl(氯化鈉)：10g。若配制固體培養基，則再加入15g?Agar(瓊脂)。

M9培養基(1L)：Na₂HPO₄·7H₂O(七水合磷酸氫二鈉)：12.8g，KH₂PO₄(磷酸二氫鉀)：3g，NaCl(氯化鈉)：0.5g，NH₄Cl(氯化銨)：lg，Glycerol(甘油)：20g。Yeast?Extract(酵母提取物)：5g，1M?MgSO₄·7H₂O(七水合硫酸鎂)1ML，0.1M?CaCl(氯化鈣)：1ML。

將所得基因工程菌在3ML含有氨芐青霉素的LB培養基中37℃，250rpm培養12小時，轉入M9培養基，M9培養基在使用前加入氨芐青霉素，37℃培養3小時，加入4μL濃度為0.5mM的IPTG誘導，并轉入30℃，250rpm培養24-48小時。

6.根據權利要求5中，利用基因工程菌大量發酵生產2,3-丁二醇的擴大培養方法，包括分批補料，流加等發酵方法。