[發明專利]表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒組及其制備與應用

有效

• 申請號: 201310485894.3
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103525775A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 孫懷昌;陳陽;郭睿;張鑫宇;夏曉莉
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A61K39/12;A61K31/14
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及生物技術與動物疫病防控領域，具體涉及表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒游離受體重組腺病毒的制備方法與應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是豬的一種高度接觸性傳染病，以母豬繁殖障礙和各種年齡豬呼吸道癥狀為主要特征。該病首次于1987年在北美發生，1996年傳入我國，給世界養豬業造成巨大的經濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）主要感染豬的單核-巨噬細胞系統，導致嚴重的細胞凋亡和免疫抑制，并能引起持續性感染。另外，該病毒不僅毒株多、變異快，還利用多種機制逃逸宿主的先天性和獲得性免疫應答，包括抑制干擾素應答、干擾抗原提呈、抗體依賴的感染促進作用、減少感染細胞表面病毒抗原表達和中和表位遮蔽。因此，現有疫苗的免疫保護效果欠佳（滅活苗）或有散毒、毒力返強風險（弱毒苗），新型疫苗研制又面臨巨大挑戰，迫切需要研究防控該病的新策略。

PRRSV利用受體依賴的胞吞機制進入靶細胞，參與巨噬細胞感染的受體至少有三個，包括非特異吸附因子硫酸乙酰肝素、吸附與進入受體唾液酸粘附素（Sn）和脫衣殼受體CD163。其中，Sn前4個免疫球蛋白樣結構域（Sn4D）參與病毒的吸附，CD163的第5個清道夫受體半胱氨酸富含（SRCR）結構域參與病毒的結合，但需要第6-9個SRCR結構域存在才具有受體功能，這些病毒結合結構域可以作為游離受體阻斷病毒感染。

與容易變異的病毒蛋白不同，病毒受體是宿主細胞編碼的保守分子，因此可作為阻斷病毒感染的理想靶點，尤其是對容易變異的RNA病毒。其中，游離受體能與細胞受體競爭結合病毒，所以能中和或抑制病毒感染，并在抗麻疹病毒、禽白血病病毒和柯薩奇病毒等病毒中得以證實。據報道，由Sn4D和人IgG?Fc片段組成的游離受體可部分抑制PRRSV感染，但人IgG?Fc片段對豬有免疫原性，所用的游離受體從重組質粒轉染細胞提取，因此豬體內使用受到限制。更為重要的是，PRRSV至少使用兩個特異受體感染巨噬細胞，單個游離受體不足以阻斷該病毒感染。至于CD163游離受體及其對PRRSV感染的阻斷作用，目前尚無報道。

發明內容

本發明用重組腺病毒表達PRRSV游離受體Sn4D-Fc和SRCR59-Fc，經融合蛋白處理病毒和重組病毒轉染細胞證明，兩個游離受體的共同作用能顯著抑制不同毒株PRRSV感染。該重組腺病毒可用較成熟的技術進行批量制備，能在注射豬體內持續表達，但不能在豬體內擴散傳播，因此可作為防治PRRSV的新型制劑進行開發。

表達PRRSV游離受體的重組腺病毒組，是由表達Sn4D-Fc和SRCR59-Fc融合蛋白的重組腺病毒組成。即由表達豬唾液酸粘附素前4個IgV結構域和與豬IgG?Fc片段融合蛋白的重組腺病毒，及表達脫衣殼受體CD163第5-9個SRCR結構域與豬IgG?Fc片段融合蛋白的重組腺病毒組成。

本發明還公開了上述表達PRRSV游離受體的重組腺病毒組在制備防治豬繁殖與呼吸綜合征制劑中的應用。

其中，所述PRRSV游離受體的重組腺病毒組通過下述方法制備:

1.用化學合成法合成豬IgG重鏈信號肽序列，用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增豬IgG?Fc片段、唾液酸粘附素前4個IgV結構域（Sn4D）和CD163第5-9個結構域（SRCR59）編碼序列。

2.將Sn4D與Fc融合序列插入腺病毒載體pShuttle-CMV，獲得重組載體pShuttle-Sn4D-Fc；將豬IgG信號肽、SRCR59與Fc融合序列插入腺病毒載體pShuttle-CMV，獲得重組載體pShuttle-SRCR59-Fc。

3.用重組載體pShuttle-Sn4D-Fc和pShuttle-SRCR59-Fc轉染AAV-293細胞，獲得重組腺病毒rAd-Sn4D-Fc和rAd-SRCR59-Fc。

4.用AAV-293細胞擴增重組腺病毒。

與現有的PRRS疫苗相比，本發明制備的重組腺病毒為復制缺陷性病毒，不存在散毒或毒力返強等風險，而且能在注射豬體內持續表達，表達的游離受體對不同毒株PRRSV感染具有穩定的抑制作用。

附圖說明