[發明專利]檢測肺炎支原體的方法及量子點標記免疫層析試紙及其制備方法

有效

• 申請號: 201310484852.8
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103529212A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 文德敏;申有長;于曉永
• 申請（專利權）人: 北京華衛天和生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 吳甘棠

技術領域

本發明涉及醫學免疫檢測方法，特別是涉及使用量子點標記免疫層析試紙，以免疫學的方法檢測肺炎支原體的方法。

背景技術

肺炎支原體(Mycoplasma?pneumoniae，MP)是介于病毒和細菌之間的一種微生物，是一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小原核細胞型微生物。MP感染可在任何年齡發生，尤其以5～20歲更多見。MP通過飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播，感染后引起肺炎支原體肺炎（Mycoplasmal?pneumonia，MPP），每隔3～5年出現一次地區性流行，占各類肺炎總數的10%～20%，入伍新兵患肺炎者30%～50%由肺炎支原體引起；約占非細菌性肺炎的1／3以上。另外還可引起肺外各系統改變，且有死亡病例報道，已引起臨床關注。

目前，常用的檢測方法是膠體金法，此法雖然檢測快速簡便，容易操作，但是準確率較低，靈敏度也較低。因此尋求一種價格便宜、操作簡便、靈敏度和特異性都較高的檢測方法是迫切需要解決的問題。

發明內容

針對上述技術的不足之處，本發明提供一種價格便宜、操作簡便、靈敏度和特異性都較高的檢測試紙以及用該試紙檢測肺炎支原體的方法。

一種量子點標記免疫層析試紙，設有塑料板、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜A、量子點標記肺炎支原體IgM單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、吸水紙；

其中，所述塑料板上依次粘貼有玻璃纖維素膜A、量子點標記肺炎支原體IgM單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；

其中，所述硝酸纖維素膜一端有肺炎支原體多克隆抗體和兔抗鼠二抗，以此形成檢測帶T和質控帶C；

其中，所述量子點標記的肺炎支原體IgM單克隆抗體位于玻璃纖維素膜B的另一端，與檢測帶T和質控帶C相對應，并且量子點標記的肺炎支原體IgM單克隆抗體位于進樣點一端。

優選的，所述量子點為CdTe/ZnSe核殼量子點。

優選的，所述塑料板為粘性PVC底板。

優選的，所述肺炎支原體多克隆抗體的濃度為0.5g/L。

優選的，所述兔抗鼠二抗的濃度為1.0g/L。

優選的，所述檢測帶T和質控帶C間距不少于5mm。

如上所述的試紙的制備方法，包括如下步驟：

（1）量子點與肺炎支原體IgM單克隆抗體的偶聯：

取0.01M的PBS緩沖液100～200uL與5～20uL表面連有羧基的量子點；

選取偶聯試劑，偶聯試劑選自羥基硫代琥珀酸亞胺、1-（3-二甲基氨丙基）-3乙基碳二胺鹽酸鹽；

加入肺炎支原體IgM單克隆抗體150～200uL；

搖床反應1～4小時；

層析柱過濾，離心純化；

用1%～5%的牛血清白蛋白封閉；

4℃保存；

（2）試紙的制備：

用0.05～0.15M的PBS緩沖液稀釋肺炎支原體多克隆抗體及兔抗鼠二抗，將0.5g/L肺炎支原體多克隆抗體和1.0g/L兔抗鼠二抗噴在硝酸纖維素膜一端，形成檢測帶T和質控帶C，T帶和C帶間隔5mm，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入PBS緩沖液中，37℃封閉待用，或者干燥后4℃保存；

將量子點標記肺炎支原體IgM單克隆抗體均勻噴覆于玻璃纖維膜B一端，與形成的T帶和C帶相對應，室溫干燥，4℃保存；

在塑料板上依次粘帖玻璃纖維素膜A、量子點標記肺炎支原體IgM單克隆抗體的玻璃纖維素膜B、硝酸纖維素膜、吸水紙；

用試紙切刀切割成試紙，干燥后密封保存。

用所述的試紙檢測肺炎支原體，包括如下步驟：將樣品點樣在組裝好的試紙上接近肺炎支原體IgM單克隆抗體的一端，反應5min后，在紫外分析儀中觀察結果。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：由于在所制備的試紙中加入了核殼量子點，特別是采用了CdTe/ZnSe水溶性核殼量子點，將水溶性的量子點與特異性的通過共價偶聯，然后利用雙抗夾心原理結合量子點的熒光性質檢測樣品中是否含有目標物。在紫外燈的照射下，通過觀察免疫層析試紙條上檢測帶和質控帶的熒光線，判斷檢測結果。本發明將免疫反應的高特異性和量子點的熒光特性相結合，利用量子點多波長激發，高強度熒光發射，發射峰窄，峰形對稱，發光穩定性好的熒光特性，建立了快速，特異，簡便，靈敏的免疫層析檢測方法。通過觀察熒光信號達到了定量檢測的目的。該方法的檢測靈敏度比目前常用的一種快速檢測方法-膠體金的檢測靈敏度高約1000倍左右。

附圖說明

圖1為試紙制備的工藝流程圖。