[發(fā)明專利]適合除草劑篩選標記Bar基因的RNA干擾載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310484523.3
• 申請日: 2013-10-17
• 公開（公告）號: CN103642827B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張玲;董英山;張原宇;張春寶;王玉民;于志晶
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司22100
• 代理人: 王薇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種適合除草劑篩選標記Bar基因的RNA干擾載體，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

常用的植物RNA干擾載體除了常規(guī)雙元載體所必備的核心元件，如啟動子，多克隆位點，抗性標記基因外，還包含一段DNA序列作為shRNA（short hairpin RNA，短發(fā)夾RNA）的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。植物RNAi干擾載體一般用細菌的GUS（轉(zhuǎn)β-葡糖醛酸酶）基因片段或植物基因的內(nèi)含子作為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。與用GUS基因作為shRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA干擾載體相比，用帶剪接位點的基因內(nèi)含子作為shRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA干擾載體具有更高的干擾效率。

在基因工程的不斷發(fā)展過程中，隨著科學技術(shù)各個分支的不斷發(fā)展和人們對基因功能認識的不斷深入，選擇標記基因也處在不斷發(fā)展完善的過程中。到現(xiàn)在為止在基因工程操作中大量應(yīng)用的選擇標記基因大體可以分為四類：分別是抗生素抗性基因、除草劑抗性基因，化合物解毒酶基因和植物糖類代謝酶基因。它們在相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上都可以起到標簽的作用，使得符合我們條件的細胞能夠突出的顯現(xiàn)出來。其中，Bar基因和草丁膦篩選體系是目前應(yīng)用最廣泛的除草劑類選擇標記篩選體系。

在將外源片段克隆到載體的分子生物學操作中，同源重組定向克隆和雙酶切連接是兩種常用的克隆方法。相比后者，前者的優(yōu)勢在于不需要用限制性內(nèi)切酶酶切目的克隆片段，克服了酶切位點的限制，同時減少了操作步驟，有助于減少工作量，提高工作效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種適合除草劑篩選標記Bar基因的RNA干擾載體，其包含設(shè)計、克隆靶基因干擾片段，篩選含有靶基因干擾片段的重組載體，檢測轉(zhuǎn)基因干擾植株等一系列操作的標準化方法；及在篩選含有靶基因干擾片段重組載體、檢測轉(zhuǎn)基因干擾植株等應(yīng)用過程中所使用的PCR檢測引物。在應(yīng)用該RNA干擾載體時，實驗操作變得簡單易行，有利于減少失誤，提高工作效率。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一種適合除草劑篩選標記Bar基因的RNA干擾載體，核苷酸序列為序列表中的序列1，包括pTF101.1載體的基本骨架、35s啟動子以及水稻GAS1基因LOC_Os01g68860內(nèi)含子、位于所述水稻GAS1基因內(nèi)含子兩側(cè)的上游多克隆位點和下游多克隆位點；

所述水稻GAS1基因內(nèi)含子的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端9621-10098位核苷酸；

所述上游多克隆位點為BamHI、SmaI（XmaI）和MluI；

所述下游多克隆位點為HpaI、SpeI和SacI；

所述干擾載體的啟動子為35s啟動子。

本發(fā)明提供的RNA干擾載體pLYZRNAi，按照如下方法制備：

將DNA片段1與pTF101-35s載體骨架共培養(yǎng)，得到的載體；

所述DNA片段1包括含有上游多克隆位點的片段a、水稻GAS1基因（LOC_Os01g68860）內(nèi)含子、含有下游多克隆位點的片段b組成；

所述水稻GAS1基因（LOC_Os01g68860）內(nèi)含子的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第9621-10098位；

所述片段a的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第9591-9620位；

所述片段b的核苷酸序列為序列表中序列1自5’末端第10099-10129位，

所述DNA片段1的核苷酸序列為序列表中序列2；

所述上游多克隆位點為BamHI、SmaI（XmaI）和MluI；

所述下游多克隆位點為HpaI、SpeI和SacI。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組載體。

本發(fā)明提供的重組載體，按照如下I或Ⅱ方法制備：

I包括如下步驟：

1）將DNA片段2插入所述的干擾載體的上游多克隆位點，得到含有所述下游多克隆位點的中間載體A；

2）將DNA片段3插入步驟1）得到的中間載體A的所述下游多克隆位點，得到重組載體；

Ⅱ包括如下步驟：

A、將DNA片段3插入所述的干擾載體的下游多克隆位點，得到含有所述上游多克隆位點的中間載體B；

B、將DNA片段2插入步驟A得到的中間載體B的所述上游多克隆位點，得到重組載體；

所述DNA片段2包括目標蛋白編碼基因片段和分別位于目標蛋白編碼基因兩側(cè)的用于插入載體的2種DNA分子，所述分別位于目標蛋白編碼基因片段兩側(cè)的用于插入載體的2種DNA分子均包括所述上游多克隆位點中的至少一種酶切位點、與所述干擾載體或與所述中間載體B同源的核苷酸；