[發(fā)明專利]重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310483648.4
• 申請(qǐng)日: 2013-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN103911388B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李相魯;張嚴(yán)冬;于為常;孟建軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東莞市麥亙生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12P21/02;C07K14/575;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 深圳市君勝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)44268
• 代理人: 劉文求

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物多肽的合成技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種改進(jìn)的重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)

糖尿病是繼心腦血管疾病、腫瘤之后的另一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的慢性非傳染性疾病，近年來，隨著人們生活方式的改變，糖尿病患病率呈急劇上升趨勢。目前我國糖尿病患者已逾7000萬，并且糖尿病患者增長率是歐美國家的2倍。2型糖尿病(Type 2 Diabetes，T2DM)是糖尿病的主體，占糖尿病患者的90％左右。T2DM是由遺傳和多種環(huán)境因素相互作用而引起胰島索分泌或作用缺陷。其患病率較高，尤以中老年人為多，并呈現(xiàn)年輕化趨勢。胰島口細(xì)胞數(shù)目減少或分泌功能障礙是導(dǎo)致T2DM發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。治療一般遵循生活方式干預(yù)(如飲食控制、運(yùn)動(dòng)治療等)、口服降糖藥和聯(lián)合使用胰島素等方式。傳統(tǒng)治療T2DM的藥物的副作用都較大，長期使用會(huì)因胰島素分泌過度導(dǎo)致胰島口細(xì)胞功能衰竭。

近年來胰高血糖素樣肽1（GLP1）和enendin－4成為糖尿病治療研究的熱點(diǎn)。因?yàn)樗鼈兙哂性谘菨舛容^高的情況下促進(jìn)胰島素分泌的特性，而在血糖正常的情況下不發(fā)揮作用，不僅可使初治的２型糖尿病患者血糖恢復(fù)正常，而且對(duì)磺脲類藥物治療失效者也有降血糖作用。

Exendin-4是一條39個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽，最初由南美巨蜥的唾液分離提取獲得。它的氨基酸殘基與哺乳動(dòng)物GLP-1序列有53％的同源性，并且生物學(xué)效應(yīng)也幾乎完全一致其與GLP-1的最大不同之處在于N端第2位的甘氨酸(Gly)耐血液中二肽基肽酶（DPP-Ⅳ），GLP-1的相同位置則為極易被DPP-Ⅳ切斷的丙氨酸（Ala），故Exendin-4被吸收入血后的半衰期較長（t1/2=9.7h ）。Exendin-4是一種強(qiáng)效GLP-1受體激動(dòng)劑，能模擬GLP-1這種內(nèi)源性多肽的糖調(diào)控作用，降低空腹和餐后血糖。艾塞那肽（Exenatide）的活性主要通過與人體胰臟GLP-1受體結(jié)合而介導(dǎo)，由環(huán)腺苷酸（cAMP）依賴和β細(xì)胞分化機(jī)制引發(fā)葡萄糖依賴的胰島素合成和分泌。因?yàn)镋xendin-4的氨基酸結(jié)構(gòu)及生物活性與GLP-1均具有相關(guān)性，故通常也被視為腸促胰島素的一種。 由于Exendin-4的降糖作用時(shí)間較長，延緩胃排空和抑制攝食沖動(dòng)對(duì)肥胖病人體重的有益作用又有別于傳統(tǒng)的降糖藥物，因此其作為2型糖尿病治療藥物開發(fā)的潛力巨大。

目前對(duì)Exendin-4進(jìn)行的藥物研究主要為制備工藝，作用機(jī)制，內(nèi)分泌代謝病臨床，分子藥理學(xué)和藥劑學(xué)研究。已上市的Exendin-4藥物（Exenatide）采用的是多肽合成法的制備工藝。

化學(xué)合成成本高（對(duì)原料氨基酸及儀器設(shè)備要求極高）、產(chǎn)量少，而利用基因工程生產(chǎn)Exendin－4，不僅可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)、有效地降低生產(chǎn)成本，而且對(duì)環(huán)境影響小，產(chǎn)品品質(zhì)更安全。但用基因工程方法直接表達(dá)生產(chǎn)Exendin-4這樣的39肽，表達(dá)水平低，且容易降解，可采用與載體蛋白(如硫氧還蛋白等)連結(jié)融合表達(dá)的方法。但這種方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所占比例很小，產(chǎn)量很低，且融合蛋白裂解后多肽種類很多，分離純化困難的問題。行之有效的增加基因的表達(dá)產(chǎn)物的方法是構(gòu)建基因串聯(lián)體，根據(jù)目標(biāo)基因的特點(diǎn)和表達(dá)產(chǎn)物的特性，運(yùn)用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)操作技術(shù)將目的基因按一定的方式串聯(lián)在一起，置于表達(dá)載體啟動(dòng)子控制之下進(jìn)行表達(dá)，再將表達(dá)的串聯(lián)體產(chǎn)物用特定的物質(zhì)(酶或化學(xué)試劑)裂解，以獲得目標(biāo)肽單體。比如pET-31b（+）是一個(gè)常用的生產(chǎn)多肽的質(zhì)粒，但是它用來生產(chǎn)多肽，當(dāng)初設(shè)計(jì)是為了避免多肽容易被大腸桿菌體內(nèi)的蛋白水解酶水解，所以讓目的多肽和KSI融合蛋白一起表達(dá)，形成了包涵體，這對(duì)生產(chǎn)Exendin-4來說是個(gè)很大的缺點(diǎn)，如果讓Exendin-4先生成包涵體再復(fù)性會(huì)造成純化成本的大大提高和活性的難以恢復(fù)，這已是重組艾塞那肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。

因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，旨在解決現(xiàn)有重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝成本高、產(chǎn)量低的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，包括構(gòu)建工程菌的步驟、發(fā)酵表達(dá)工程菌的步驟和純化目的蛋白的步驟；

其中，構(gòu)建工程菌的步驟包括：

（1）重組Exendin－4多肽基因序列的人工合成：根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性，設(shè)計(jì)編碼Exendin－4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No.1所示的目的基因；