[發明專利]重組艾塞那肽的生產工藝

有效

• 申請號: 201310483648.4
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103911388B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 李相魯;張嚴冬;于為常;孟建軍
• 申請（專利權）人: 東莞市麥亙生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C07K14/575;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 深圳市君勝知識產權代理事務所(普通合伙)44268
• 代理人: 劉文求

1.一種重組艾塞那肽的生產工藝，包括構建工程菌的步驟、發酵表達工程菌的步驟和純化目的蛋白的步驟；

其中，構建工程菌的步驟包括：

（1）重組艾塞那肽多肽基因序列的人工合成：根據大腸桿菌密碼子偏愛性，設計編碼艾塞那肽的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No.1所示的目的基因；

（2）MAG2010質粒：取pET-31b(+)質粒，將pET-31b(+)中的KSI融合基因序列完全刪除，同時刪除限制性內切酶AlwnI酶切位點和3’端組氨酸標記以及終止子，在刪除的位置，取代以蛋氨酸-6X組氨酸-GB1標簽序列-腸激酶裂解位點序列，將改造的pET-31b(+)形成的新質粒重新命名為Mag2010；

（3）工程菌的構建：將艾塞那肽基因序列切割并純化，然后克隆到改造好的Mag2010質粒中的腸激酶裂解位點序列，目的基因3’端添加有雙重終止子，得到重組質粒pET-31 b (+)-艾塞那肽，將重組質粒pET-31 b (+)-艾塞那肽以CaCl₂法轉化受菌體BL21(DE3) plays，在37℃下在LB培養基中進行培養，收集菌體，篩選陽性克隆，作為重組艾塞那肽融合表達的工程菌；

發酵表達的步驟包括：

（1）挑單菌落到30 mL 目標培養基中，31℃，200rpm活化過夜；

（2）將30mL菌液接到200 mL 2XYT培養基中，32℃，200rpm 培養約2.6 hr；

（3）以10％的接種量，接到5 L MMBL培養基中，32℃，240rpm培養約3 hr；

（4）接到60 L發酵培養基中；

（5）控制生長期pH為6.8；用攪拌速度及通氣量使DO≥10% ；待培養基中葡萄糖的濃度降至0.2g/L時開始補料；當OD550達到10左右時加入13 mL 1M IPTG誘導，終濃度為0.2mM，把pH緩慢調至7.00，繼續培養10 小時后結束；

純化目的蛋白的步驟采用離子交換層析-Sephadex G-50凝膠過濾層析-三明治型的親和層析進行分離和純化；該工程菌經過發酵、純化得到的重組艾塞那肽的產量達到500毫克/升的產率；

其特征在于，對艾塞那肽進行酰胺化處理；

所述酰胺化處理包括：

將磁珠固定化的體系終濃度為1.0mM的羧肽酶Y，或者體系終濃度為1.0mM的羧肽酶A溶于N-苯丙氨酸甲酯中，加入25毫升的氨水和體系終 濃度為0.4M的重組艾塞那肽，體系終濃度為5mM的 EDTA , 反應體系總體積共計500毫升， 在75℃下反應20個小時，8000rpm 離心5分鐘，酰胺化的重組艾塞那肽，用HPLC進行純化, 用10%-100%甲醇或者乙腈溶液進行洗脫，收集樣品，所得樣品利用減壓蒸發除去有機溶劑，重溶于醋酸鹽緩沖液中，然后真空干燥得到白色粉末狀酰胺化艾塞那肽，并于-20℃保存；

所述三明治型的親和層析包括親和層析一、酶裂解和親和層析二，具體步驟如下：

（1）親和層析一：采用GE 公司的IgG- sepharose-fast flow column,首先用3個柱體積的50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCI的緩沖液平衡柱子，然后將用相同緩沖液透析過的蛋白質上柱，用1倍體積上述緩沖液洗然后用5mM 乙酸鈉，pH5.0的緩沖液洗去未結合的雜質，接著用500mM 乙酸鈉，pH5.0的緩沖液將目的蛋白洗脫下來，收集、濃縮，用足量的20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6 透析12小時；

（2）腸激酶處理：1 μl的重組牛腸激酶輕鏈亞基在20℃，20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.6的條件下8h可以完全切割融合蛋白；

（3）親和層析二：將上述處理過的重組艾塞那肽結合在鎳柱上，先用起始緩沖液洗脫磷酸鹽緩沖液，保留洗脫組分，濃縮，冷凍干燥，得到重組的艾塞那肽。