[發(fā)明專利]一種抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310483217.8
• 申請(qǐng)日: 2013-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN103524615A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張智;李再新;謝萬如;胡衛(wèi)東;李天有;鄒曉陽;李丙超;陸仕海
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川理工學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K16/10
• 分類號(hào): C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51214
• 代理人: 吳彥峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗兔病毒性出血癥病毒卵黃抗體的制備，屬于生物工程與畜病防治技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

兔病毒性出血癥(俗稱兔瘟)是由兔病毒性出血癥病毒(?rabbit?hemorrhagic?disease?virus,?RHDV)?引起的兔的一種烈性傳染病，具有高度致死性、傳染性特點(diǎn)。自1984年在中國(guó)首先發(fā)現(xiàn)以來，本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)兔業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和威脅，而且嚴(yán)重威脅瀕臨滅絕的野兔品種。目前該病尚無有效治療藥物，針對(duì)RHDV只能采取疫苗預(yù)防，疫苗接種7-10天后才能產(chǎn)生足夠抗體，不能及時(shí)有效保護(hù)。由于RHDV目前無法在體外細(xì)胞系中得到病毒擴(kuò)增，因此均采用將RHDV毒株感染家兔后，處死家兔，取其被病毒感染的組織，滅活后制備成組織滅活疫苗，在整個(gè)這個(gè)過程中存在病毒散毒的危險(xiǎn)，且不符合動(dòng)物福利的要求。

卵黃抗體（immunoglobulin?yolk,?IgY）技術(shù)簡(jiǎn)稱IgY技術(shù)，即產(chǎn)蛋雞經(jīng)特定抗原免疫后，產(chǎn)生相應(yīng)特異性抗體，并轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存于卵黃中，形成卵黃抗體。IgY是雞蛋卵黃中的多克隆抗體，生物學(xué)特性除了具有其他動(dòng)物源性IgG抗體的高度特異性、敏感性之外，其還具有更強(qiáng)的抗原親和力、耐熱、耐酸堿、制備成本低等突出優(yōu)點(diǎn)。由于IgY生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，是一種非常好的可以替代其它動(dòng)物血清治療的抗體藥物，目前在人和動(dòng)物被動(dòng)免疫治療和診斷方面表現(xiàn)出了良好的臨床效果。關(guān)于IgY的作用機(jī)制，主要是通過與病原體細(xì)菌或病毒直接結(jié)合，抑制病原體的生長(zhǎng)和繁殖，阻斷其對(duì)人和動(dòng)物正常細(xì)胞的粘附和感染作用。

經(jīng)對(duì)現(xiàn)有的專利、技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，張宏偉等人2007年在其中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的碩士論文“抗兔病毒性出血癥卵黃抗體的制備與應(yīng)用”中，將兔病毒性出血癥組織滅活疫苗免疫普通產(chǎn)蛋雞；采用辛酸-硫酸氨二步鹽析法-離子層析交換法，從卵黃液中提取高效價(jià)的兔病毒性出血癥卵黃抗體，且其對(duì)攻毒兔的治療率達(dá)100%。王治方等人在《中國(guó)養(yǎng)兔雜志》2007年第4期上發(fā)表的“抗兔瘟精制卵黃抗體的研制”一文中，將兔病毒性出血癥組織滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋雞；采用3.5%-4.0%的聚乙二醇6000和超濾的方法提取到兔病毒性出血癥卵黃抗體，且其對(duì)攻毒兔的早期治療率達(dá)80%。兩論文中，由于RHDV目前無法在體外細(xì)胞系中得到病毒擴(kuò)增，因此均采用各自分離的RHDV毒株，感染家兔后，處死家兔制備成組織滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，但在整個(gè)這個(gè)過程中存在散毒的危險(xiǎn)，且不符合動(dòng)物福利的要求。采用辛酸-硫酸氨二步鹽析法-離子層析交換法提取卵黃抗體，過程較為復(fù)雜，成本高；而采用聚乙二醇的方法，張小鶯等在2011年出版的《卵黃抗體技術(shù)》書中，總結(jié)前人的研究結(jié)果表明，用PEG的方法提取卵黃抗體得率較水稀釋和超濾法等低，在王治方等人的論文中未見其卵黃抗體的產(chǎn)率報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足和缺陷，提供一種抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法。采用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)在體外大量表達(dá)兔RHDV的VP60抗原，將純化的VP60抗原經(jīng)適宜的佐劑乳化后免疫產(chǎn)蛋雞，并從雞蛋中提取和純化出高滴度的抗兔RHDV卵黃抗體，最后經(jīng)冷凍干燥制備成抗體干粉，于-20℃或-80℃。經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后，用生理鹽水溶解該卵黃抗體干粉，適用于兔病毒性出血癥RHDV的早期治療和緊急預(yù)防使用，是一種新的安全、成本低、高效預(yù)防和治療兔病毒性出血癥的抗體制備方法。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：?

一種抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法,包括以下步驟：

??（1）?免疫原的制備：通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得RHDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP60的N端250個(gè)氨基酸序列VP60-N，并實(shí)現(xiàn)其在基因工程菌中的表達(dá)，通過分離純化獲得VP60-N重組抗原；

（2）免疫產(chǎn)蛋雞及提取卵黃抗體：將純化的VP60-N抗原蛋白經(jīng)佐劑乳化免疫產(chǎn)蛋雞，檢測(cè)抗體的純度、特異性及滴度后，大量提取純化IgY卵黃抗體，冷凍干燥后將抗體干粉凍存；

（3）制劑的制得：檢測(cè)步驟（2）中得到的IgY卵黃抗體干粉，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后，與生理鹽水制備成安全的皮下或靜脈注射用抗體制劑，或冷凍干燥形成干粉制劑后保存。

所述的RHDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP60的N端250個(gè)氨基酸序列VP60-N如下：