[發明專利]一種抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201310483217.8
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103524615A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 張智;李再新;謝萬如;胡衛東;李天有;鄒曉陽;李丙超;陸仕海
• 申請（專利權）人: 四川理工學院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 吳彥峰

1.一種抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法,?其特征在于包括以下步驟：

（1）?免疫原的制備：通過PCR擴增技術獲得RHDV的結構蛋白VP60的N端250個氨基酸序列VP60-N，并實現其在基因工程菌中的表達，通過分離純化獲得VP60-N重組抗原；

（2）免疫產蛋雞及提取卵黃抗體：將純化的VP60-N抗原蛋白經佐劑乳化免疫產蛋雞，檢測抗體的純度、特異性及滴度后，大量提取純化IgY卵黃抗體，冷凍干燥后將抗體干粉凍存；

（3）制劑的制得：檢測步驟（2）中得到的IgY卵黃抗體干粉，經無菌檢驗合格后，與生理鹽水制備成安全的皮下或靜脈注射用抗體制劑，或冷凍干燥形成干粉制劑后保存。

2.?根據權利要求1所述的抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法，其特征在于：所述的RHDV的結構蛋白VP60的N端250個氨基酸序列VP60-N如下：

SEQ?ID?NO.1:?GKARAAPQGE?AAGTATTASV?PGTTTDGMDP?GVVATTSVIT?AENSSASIAT?AGIGGPPQQV?DQQETWRTNF?YYNDVFTWSV?ADAPGSILYT?VQHSPQNNPF?TAVLSQMYAG?WAGGMQFRFI?VAGSGVFGGR?LVRAVIPPGI?EIGPGLEVRQ?FPHVVIDARS?LEPVTITMPD?LRPNMYHPTG?DPGLVPTLVL?SVYNNLINPF?GGSTSAIQVT?VETRPSEDFE?FVMIRAPSSK????TVDSISPAGL?LTTPVLTGVG。

3.?根據權利要求1所述的抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法，其特征在于：所述PCR擴增的引物為：

上游引物?：5’-?CCGGAATTCEcoR?I?ATGGAGGGCAAAGCCCGCA-3’，

下游引物?：5’-?CCGCTCGAGXho?I?ATTGCCAACACCAGTGA-3’；

?PCR退火溫度為52-55℃。

4.?根據權利要求1所述的抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法，其特征在于：步驟（1）中免疫原的制備具體為：分析和選擇兔RHDV病毒VP60的主要抗原表位決定簇肽段，即N端1-250aa肽段（VP60-N）作為免疫原；采用PCR的方法，以VP60全長基因序列為模板擴增VP60-N片段；通過基因工程技術，將該片段克隆到原核表達載體pET28a(+)上，轉化基因工程菌BL21（DE3），完成VP60-N重組抗原蛋白的原核誘導表達；最后純化重組的VP60-N抗原蛋白。

5.?根據權利要求4所述的抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法，其特征在于：PCR擴增后的產物，經EcoR?I?和Xho?I酶切回收后，與同樣經過雙酶切處理的pET28a(+)原核表達載體進行連接和轉化，形成重組質粒pET28a-VP60-N；將重組質粒pET28a-VP60-N轉化E.coli?BL21(DE3)，次日挑取單菌落接種于3?ml含卡那霉素的LB液體培養基，于37℃，150?rpm振蕩培養；過夜培養后，按1：200接種擴大培養，待菌液OD?600值為0.6-0.8時加入終濃度為0.5?mM?IPTG誘導，溫度為22℃-30℃；誘導8-12?h后，12000?rpm離心收集菌體，加入終濃度為10?mg/ml的溶菌酶，冰浴1h，采用4次反復凍融法裂解菌體，12000?rpm離心15?min，收集上清，SDS-PAGE檢測確定VP60-N重組蛋白以可溶形式表達后，使用Ni-NTA樹脂純化VP60-N重組蛋白抗原。

6.?根據權利要求1所述的抗兔病毒性出血癥病毒RHDV卵黃抗體的制備方法，其特征在于：步驟（2）中免疫產蛋雞的方法為將純化的VP60-N重組抗原與弗氏佐劑按1:1混合乳化3-5h，之后2-3點肌肉注射免疫產蛋雞；第一免疫后每隔一個月加強免疫一次，共加強免疫2次，第三次免疫后的第二周開始收集雞蛋；檢測蛋黃中VP60-N特異性的抗體滴度達到1:20000以上時為合格；采用水稀釋法-超濾法從雞蛋蛋黃中分離純化出RHDV特異性的卵黃抗體IgY。