[發明專利]一種豬圓環病毒2型高敏感細胞系的制備方法

有效

• 申請號: 201310481480.3
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103497932A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 任林柱;陳福旺;楊鑫;歐陽紅生;逄大欣;曹宇航;張明軍;董美辰
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/113;C12Q1/68;C12R1/91
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.?一種對豬圓環病毒2型高敏感的細胞系，其特征在于：

用RNA干擾技術沉默PK-15細胞中與PCV2感染密切相關的HMGCR基因，并獲得穩定細胞系，利用此細胞系培養PCV2病毒，可使病毒TCID50達到10^8-9/mL。

2.?權利要求1所述的對豬圓環病毒2型高敏感的基因沉默細胞系的制備方法，包括以下步驟：

1）HMGCR基因沉默載體的制備

1.1）用于HMGCR基因沉默的shRNA序列：

根據豬PK-15細胞的HMGCR基因序列特點，設計用于HMGCR基因沉默的shRNA，其序列為

5'-caccgcagaaactgacacctcaag?cttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；

同時設有陰性對照shRNA，其序列為：

5'-caccgttc?tccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；

1.2）HMGCR基因沉默載體：

將設計的shRNA序列合成并連接到pGPH1/GFP/Neo?siRNA?(GenePharma,?China)表達載體上；

2）HMGCR基因沉默細胞的制備

2.1）載體線性化：提取HMGCR基因沉默質粒，用限制性內切酶BamHI酶切，然后乙醇沉淀回收線性DNA片段，用無菌ddH2O溶解；

2.2）脂質體轉染：將線性化的載體按照脂質體Fugene?HD說明書的方法轉染PK-15細胞，DMEM培養液，5?%?CO2，37?℃培養；

2.3）HMGCR基因沉默細胞的獲得及鑒定：上述經脂質體轉染后的細胞用G418篩選8-10天后，獲得抗性細胞；采用Western?blotting方法和Relative?quantitative?real-time?PCR對所獲得的細胞進行鑒定，得到HMGCR基因沉默的細胞；?

3）HMGCR基因沉默細胞活力的測定

按照CellTiter?96??AQueous?One?Solution?Cell?Proliferation?Assay?(Promega)的方法測定上述HMGCR基因沉默細胞的活力；

4）對豬圓環病毒2型（PCV2）高敏感的基因沉默細胞的篩選

選取上述HMGCR基因沉默且活力較強的細胞，接種PCV2病毒，用IFA法測定病毒滴度、用Relative?quantitative?real-time?PCR測定病毒基因組拷貝數。

3.一種真核表達載體pGPH1/GFP/Neo?siRNA-HMGCR，其特征在于：是在pGPH1/GFP/Neo?siRNA表達載體的基礎上，插入人工合成的shRNA片段而成。

4.?用于沉默PK-15細胞的HMGCR基因的shRNA，其特征在于其序列為：

Sense：

5'-caccgcagaaactgacacctcaagcttcaagagagcttgaggtgtcagtttctgcttttttg-3'；

Antisense：

5'-gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgc-3'；

陰性對照shRNA，其序列為：

Control?Sense：

5'-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；

Control?Antisense：

5'-gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaac-3'。

5.HMGCR基因沉默細胞的Relative?quantitative?real-time?PCR鑒定方法，用于HMGCR基因沉默細胞的鑒定，其特征在于引物序列如下：

HMG3：5'-tatccgtttccagtccaggt-3'；

HMG4：5'-ttacagcagcaggtttcttg-3'。