[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒2型高敏感細胞系的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310481480.3
• 申請日: 2013-10-16
• 公開（公告）號: CN103497932A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設計）人: 任林柱;陳福旺;楊鑫;歐陽紅生;逄大欣;曹宇航;張明軍;董美辰
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/113;C12Q1/68;C12R1/91
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域：

本發(fā)明提供了一種對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）高敏感的細胞系，同時還公開了該細胞系的制備方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

豬圓環(huán)病毒2型引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。目前，本病無有效的治療方法。另外，雖然利用常規(guī)PK-15細胞可以培養(yǎng)PCV2，但PCV2難培養(yǎng)、生長慢，全病毒培養(yǎng)物在滅活前的病毒含量也只能達到10^5.5-6.0?TCID50/mL，嚴重制約了PCV2全病毒滅活疫苗的生產，因此，研究獲取足量PCV2的有效方法十分必要。目前，提高PCV2滴度的方法主要有：

（1）在細胞培養(yǎng)液中填加免疫激活劑、氨基葡聚糖等化學物質。但這些方法操作復雜、花費較高，不利于在工業(yè)化生產PCV2全病毒滅活疫苗中使用。

（2）篩選對PCV2高度易感且穩(wěn)定的細胞系。

但國內外相關研究均是用常規(guī)PK-15細胞經過有限稀釋后獲得對PCV2敏感的細胞系，尚未見用轉基因或基因沉默的方法制備PCV2高易感細胞系的報道。

發(fā)明內容：

本發(fā)明公開了一種對豬圓環(huán)病毒2型高敏感的細胞系，利用此細胞系培養(yǎng)PCV2病毒，可使病毒TCID50達到10^8-9/mL。

本發(fā)明還提供了豬圓環(huán)病毒2型高敏感的基因沉默細胞系的制備方法，適用于人工制備豬圓環(huán)病毒2型高敏感的細胞系。

本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒2型高敏感細胞系，其特征在于：

用RNA干擾技術沉默PK-15細胞中與PCV2感染密切相關的HMGCR基因，并獲得穩(wěn)定細胞系，利用此細胞系培養(yǎng)PCV2病毒，可使病毒TCID50達到10^8-9/mL。

本發(fā)明公開了一種真核表達載體pGPH1/GFP/Neo?siRNA-HMGCR，用于構建HMGCR基因沉默的細胞系：

本發(fā)明構建的真核表達載體pGPH1/GFP/Neo?siRNA-HMGCR是在pGPH1/GFP/Neo?siRNA表達載體的基礎上，插入人工合成的shRNA片段而成。

本發(fā)明還提供了用于沉默PK-15細胞的HMGCR基因的shRNA，其序列為：

Sense：

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Antisense：

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同時設有陰性對照shRNA，其序列為：

Control?Sense：

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Control?Antisense：

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本發(fā)明所述豬圓環(huán)病毒2型高敏感細胞系的構建方法，包括以下步驟：

1）HMGCR基因沉默載體的制備

1.1）用于HMGCR基因沉默的shRNA序列：根據豬PK-15細胞的HMGCR基因序列特點，設計用于HMGCR基因沉默的shRNA，

其序列為：

Sense：

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Antisense：

5'-gatccaaaaaagcagaaactgacacctcaagctctcttgaagcttgaggtgtcagtttctgc-3'；

同時設有陰性對照shRNA，其序列為：

Control?Sense：

5'-caccgttctccgaacgtgtcacgtcaagagattacgtgacacgttcggagaattttttg-3'；

Control?Antisense：

5'-gatccaaaaaattctccgaacgtgtcacgtaatctcttgacgtgacacgttcggagaac-3'。