[發明專利]果蠅腸道免疫相關基因的篩選方法

無效

• 申請號: 201310479061.6
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103598147A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 金麗華;郝陽光;劉強
• 申請（專利權）人: 東北林業大學;金麗華
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于果蠅天然免疫領域，本發明涉及一種篩選果蠅腸道免疫相關基因的方法。

背景技術

腸道粘膜除具有消化吸收功能外，還是內部與外部環境之間的一種屏障，能夠保護宿主免受病原微生物的入侵，同時也是菌群與宿主免疫系統的調節者。當受到外界環境的不斷地刺激時，腸道上皮細胞會對內部和外部因子作出應答進而確保它們自身的生存及適當的腸道內環境。近年來，越來越多的人受到腸道炎癥疾病的困擾，而且長時間的炎癥及組織損傷將導致腸道的癌變及腫瘤的形成。雖然人體可通過天然和獲得性免疫來抵抗腫瘤，但現實條件下由于廣泛的免疫逃逸機制的存在，腫瘤極少能自然消退。因此，闡明腸道上皮細胞與多種微生物之間的相互作用及共生菌群參與宿主胞內信號通路的調節機制對于腸道疾病的治療具有重要的指導意義。

果蠅作為一個經典的實驗模型已逐漸地應用于腸道免疫的研究，一些重要的影響腸道免疫的信號通路已經建立，近幾年的研究熱點主要集中在ROS（活性氧）及局部AMPs（抗菌肽）的產生，這兩種重要的互補效應機制控制著腸道微生物的感染。在果蠅腸道中，NADPH氧化酶DUOX參與產生的ROS為抵抗微生物的入侵提供了有效的保護屏障，而IMD(Immune?deficiency)信號通路誘導的局部AMPs的表達在腸道免疫中也發揮了重要的作用。同時為避免長時間過度的免疫反應，果蠅腸道會通過多種調節機制來限制IMD通路的活性及ROS的產生，這些保護機制也是維持共生菌及非病原菌生長所需要的條件。此外，腸道干細胞（ISCs）能通過增殖和分化來修復由微生物感染引起的腸道上皮細胞的損傷，而調節果蠅腸道干細胞分化的調節機制也正逐漸被闡明。已知腸道干細胞的分化受多種信號通路的調節，主要包括:Notch、Wnt、BMP(Bone?Morphogenic?Protein)、MAPK(Mitogen-Activated?Protein?Kinase)、JAK-STAT(Janus?Kinase?and?Signal?Transducer?and?Activator?of?Transcription)等信號途徑。有研究發現，損傷的腸細胞能分泌細胞因子Upd3，它能夠激活JAK-STAT信號通路，進而促進腸道干細胞增殖及上皮細胞再生，同時發現JNK(c-Jun?N-terminal?Kinases)途徑也能對微生物感染引起的腸道損傷作出免疫應答。而Hippo信號通路能通過抑制JAK-STAT和EGFR(Epidermal?Growth?Factor?Receptor)信號通路的激活因子來負調控腸道干細胞的分化。

果蠅與人類的腸道具有相似的結構和功能，腸道干細胞的分化機制也十分相似，同時癌基因與腫瘤基因在果蠅與人類之間也是高度保守的，因此闡明果蠅腸道免疫調節機制及腸道干細胞分化機制對揭示人類腸道相關疾病的發病機制具有重要的指導作用。然而，盡管近年來果蠅模型已為腸道免疫的研究提供了大量的信息，但一些重要的問題仍有待解決，例如，腸道上皮細胞區分共生菌群與病原菌群的機制還未被闡明，共生菌群誘導的NF-κB活性與ROS的基礎性表達對宿主的意義也尚不清楚，一些重要信號通路的調控因子還未被發現。因此，本領域有必要開發一種系統且高效的篩選果蠅腸道免疫基因的方法，從而有利于研究者更好的理解復雜的腸道免疫調節機制，同時也為治療腸道疾病提供新的思路。

發明內容

本發明的目的在于提供一種初步篩選果蠅腸道免疫相關基因的方法，該方法通過給基因突變體果蠅喂食不同種類的微生物（Micrococcus?luteus和Beauveria?bassiana孢子）、過氧化物（H₂O₂）、高鹽離子（NaCl）以及表面活性劑（SDS）后，觀察突變體果蠅生存率，腸道的形態變化及細胞凋亡，從而能夠簡便、快速的初步篩選出與果蠅腸道免疫相關的基因。

本發明所采用的技術方案包括如下步驟：

（1）突變體果蠅的獲得

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（2）生存率實驗中喂食果蠅所需菌液及化學試劑溶液的配制方法：

1）Micrococcus?luteus菌菌液的配制：將保種Micrococcus?luteus菌菌液按1:100比例接種于LB液體培養基中，37℃振蕩過夜培養后測其OD₆₀₀值，離心后收集菌體沉淀，在菌體沉淀中加入蔗糖并用去離子水定容，使Micrococcus?luteus菌菌液終濃度達到OD₆₀₀=150，蔗糖的終濃度為5%。