[發(fā)明專利]分離脂肪組織活細(xì)胞方法、醫(yī)藥組合物及其用途、細(xì)胞庫

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310478269.6
• 申請(qǐng)日: 2013-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN104560862B
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫立易;李典錕;馮清榮;張耀仁
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 佛教慈濟(jì)醫(yī)療財(cái)團(tuán)法人
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;A61K48/00;C40B40/02;A61P25/00;A61P19/00
• 代理公司: 北京戈程知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉

1.一種分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于，包括有下列步驟：

步驟a提供一人類的脂肪組織；

步驟b將該脂肪組織置于一切割裝置的封閉容器中；

步驟c使該切割裝置對(duì)該封閉容器施予一作用力，令該封閉容器中的一預(yù)設(shè)切削刀具對(duì)該脂肪組織執(zhí)行快速均質(zhì)切碎，獲得一均質(zhì)化脂肪組織；

步驟d于前述已切碎的該均質(zhì)化脂肪組織中加入一試劑，進(jìn)行水解反應(yīng)；

步驟e將前述經(jīng)水解反應(yīng)處理過的該均質(zhì)化脂肪組織進(jìn)行過濾、離心分離；及

步驟f將離心分離后的上清液移除，以獲取一細(xì)胞沉淀物，其中前述步驟b中所述的切割裝置是一拋棄式的均質(zhì)機(jī)，前述拋棄式的均質(zhì)機(jī)包含有一拋棄式封閉容器及一動(dòng)力單元，且該拋棄式封閉容器內(nèi)具有一切削刀具；前述步驟c均質(zhì)切碎條件為于15毫升體積的拋棄式封閉容器內(nèi)置入3公克至6公克脂肪組織，且所述均質(zhì)機(jī)的轉(zhuǎn)速為1200每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)至1500每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，而作用時(shí)間為3分鐘至10分鐘，以進(jìn)行快速均質(zhì)切碎。

2.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：于步驟a前可包含一以磷酸緩沖溶液清洗前述脂肪組織的步驟。

3.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：步驟c均質(zhì)切碎較佳條件為于15毫升體積的拋棄式封閉容器內(nèi)置入3公克脂肪組織，進(jìn)行快速均質(zhì)切碎。

4.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：前述步驟d中所述的試劑是選自一胰蛋白酶(Trypsin)、一中性蛋白酶(Dispase)、一膠酶(Gelatase)、一玻尿酸酶(Hyaluronidase)、一第一型膠原蛋白酶(Collagenase type I)或一第四型膠原蛋白酶(Collagenase type IV)所構(gòu)成群組之一或其組合。

5.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：前述步驟d中所述的水解反應(yīng)是全程置于一恒溫雜交反應(yīng)烘箱中進(jìn)行，且條件為攝氏4度至45度、轉(zhuǎn)速為5每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)至50每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，以及時(shí)間0.5小時(shí)至24小時(shí)。

6.如權(quán)利要求5所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：條件為攝氏37度、轉(zhuǎn)速為15每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)以及時(shí)間8小時(shí)。

7.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：前述步驟e中所述離心的條件為400×g、時(shí)間10分鐘。

8.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：前述步驟e更包含將過濾掉脂肪組織碎渣后所得一過濾液移入一離心管的步驟，以進(jìn)行離心分離。

9.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：前述步驟f中所述的細(xì)胞沉淀物是一基質(zhì)血管層細(xì)胞。

10.如權(quán)利要求1所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：前述步驟f之后更包括一步驟g將磷酸緩沖溶液加入前述細(xì)胞沉淀物中，清洗前述細(xì)胞沉淀物，再次離心以去除含有血水及前述試劑的上清液，獲得一清洗后的細(xì)胞沉淀物。

11.如權(quán)利要求10所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：前述步驟g之后更包括一步驟h將前述清洗后的細(xì)胞沉淀物置入一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以獲取一擴(kuò)增的細(xì)胞。

12.如權(quán)利要求11所述的分離脂肪組織活細(xì)胞中的基質(zhì)血管層細(xì)胞的方法，其特征在于：所述培養(yǎng)基包含：一基礎(chǔ)培養(yǎng)基、一血清添加物、一第二型纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子。