[發明專利]柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201310478221.5
• 申請日: 2013-10-15
• 公開（公告）號: CN103524616A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 呂娜;張捷
• 申請（專利權）人: 浙江萬里學院
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 白冬冬

1.一種柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

a、采用甲醛滅活的方法制備病原菌顆粒性抗原；

b、取a作為抗原，與弗氏完全佐劑等體積混合，免疫健康白兔；

c、兩周后取a與弗氏不完全佐劑等體積混合，對b中白兔采用同樣方法進行二次免疫，采用間接ELISA法監測抗血清效價，并按每隔兩周免疫一次的方式進行第三、四次免疫，第四次免疫兩周后單獨用顆粒性免疫原沖擊免疫一次；

d、收集白兔血液，分離抗血清；

e、純化抗血清，得到目標多克隆抗體，并鑒定其蛋白含量、效價及特異性；

步驟a中的病原菌為柱狀黃桿菌G_4R3，為柱狀黃桿菌的代表類群。

2.根據權利要求1所述的柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟a中顆粒性抗原的制備方法為：取穿刺菌種接種至胰胨液體培養基中，27℃搖床活化24h；將活化后的菌液做平板劃線分離；單克隆菌落轉接至100ml胰胨液體培養基中增菌；菌液用新鮮配制的液體培養基做適當梯度稀釋，采用分光光度法法測定各稀釋度菌液的OD₆₀₀值，結合平板菌落計數法計數菌液濃度，制備活菌數與OD₆₀₀值的標準曲線，根據標準曲線計算菌液濃度將擴增的菌液離心，并用無菌生理鹽水洗脫，棄上清，反復2次，離心收集菌體；生理鹽水重懸，并于重懸菌液加入0.5%的甲醛4℃滅活24h，制備柱狀黃桿菌顆粒性抗原；24?h后將滅活菌液離心棄上清，沉淀用滅菌生理鹽水洗滌3次，調整菌液濃度。

3.根據權利要求1所述的柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟a中用于培養柱狀黃桿菌的培養基為胰胨培養基，培養條件為：27℃培養24-36h，其中胰胨培養基：0.5‰胰蛋白胨，0.2‰牛肉膏，0.5‰酵母浸粉，醋酸鈉0.2‰，1?moL/L?NaOH調pH至7.2-7.4，高壓滅菌20min。

4.根據權利要求1所述的柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟b中，實驗動物為2kg健康雄性新西蘭白兔；免疫方法采用背部脊柱兩側皮下5點注射免疫，免疫劑量為0.5×10⁹cfu/只。

5.根據權利要求1所述的柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟b和步驟c中，采用的是漩渦震蕩乳化劑逐滴加入顆粒性抗原的方法：取滅菌的青霉素瓶，按需要量加入弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，蓋好滅菌膠塞，用漩渦震蕩器使之高速旋轉，用滅菌注射器吸取與佐劑等體積的顆粒性細菌抗原逐滴加入佐劑中，可見抗原液滴入后在佐劑中呈球狀并逐漸變小消失；抗原溶液全部加完后再渦旋15?min，采用滴入靜止的冷水液面5?min不擴散的方法檢測是否制成油包水的乳劑；由于液體在漩渦震蕩過程中會釋放大量熱量，為較好的保存抗原性，青霉素瓶每震蕩5min后置于冰浴中1min。

6.根據權利要求1所述的柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟c中，為獲得高效價的抗體，還應在每次免疫完一周后耳緣靜脈采血檢測血清抗體效價，當抗體效價達到最大值時，可以分離免疫動物血清。

7.根據權利要求1所述的柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：間接ELISA檢測法，包括如下步驟：

a.用顆粒性抗原包被酶標板，洗板；

b.用含3%牛血清白蛋白的PBST封閉包被的酶標板，洗板；

c.加待檢血清或抗體，洗板；

d.加酶標二抗，洗板；

e.加底物OPD顯色；

f.?2?mol/L硫酸終止反應；

g.用酶聯免疫檢測儀在波長492nm處，讀吸光值。

8.根據權利要求1所述的柱狀黃桿菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于：步驟e中，抗血清的純化方法采用辛酸-硫酸銨法純化，具體操作如下：在收集的抗血清中加入4倍體積的0.06?mol/L?pH?4.0的醋酸緩沖液，用0.1mol/L?NaOH調pH至4.8；

電磁攪拌下緩慢滴入正辛酸至終濃度為33μL/mL以沉淀非IgG蛋白，繼續磁力攪拌30min后，4℃靜置2h，12000rpm離心30?min，除去沉淀；

取上清并加入1/10體積的0.1mol/L?PBS，用2mol/L?NaOH小心調節pH至7.4，在4℃冰浴下加入硫酸銨至終濃度為0.277g/mL，攪拌30min，4℃靜置2h,?10000rpm離心30?min；

棄上清，將沉淀溶于0.2mL?0.01mol/L?PBS中，用0.01mol/L?PBS于4℃透析過夜，期間每?3～4h換液一次，之后于4℃?5000g離心20min，去除不溶性沉渣，上清用PBS?稀釋至純化前相同體積，于-20℃凍存。