[發明專利]一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201310477885.X
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103525823A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 朱慧蘭;李潤祥;梁碧華;李振潔;龔業青;馬少吟;高愛莉
• 申請（專利權）人: 朱慧蘭
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/79;C07K16/46;C07K16/28;A61P17/00
• 代理公司: 廣州市一新專利商標事務所有限公司 44220
• 代理人: 王德祥

技術領域

本發明涉及嵌合抗體，具體涉及一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法。

背景技術

CD20?是一種非糖化的細胞膜跨膜磷蛋白，它由297個氨基酸組成，相對分子質量為35?×10³，表達于95％?以上正?；驉夯腂細胞表面。一直被認為是B系細胞表面特有的標識。CD20抗原的表達嚴格限制在前B淋巴細胞的晚期和成熟B淋巴細胞，在造血干細胞、祖細胞和其它正常組織中無CD20?抗原的表達。當B淋巴細胞分化為分泌抗體的漿細胞時，CD20抗原的表達也隨之消失。人與鼠的CD20?同源性可達73％。雖然CD20的功能仍沒有完全闡述清楚，但目前研究發現，CD20抗原是信號傳導復合物的一部分，其功能類似于鈣離子通道，參與調節B淋巴細胞的生長和分化，具體的作用包括抑制B細胞從G1期進入S/G2+M期；動員胞內的鈣儲存庫使鈣離子濃度升高；激活酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，使caspase活化。CD20與抗CD20抗體結合后內化現象不明顯，因此細胞表面CD20分子數量并不因為與抗體結合而大量減少。CD20也不會發生明顯細胞表面脫落的現象，在人體血清中無游離的CD20存在。因此CD20抗原是B細胞靶向治療的理想作用位點?，F在已將抗CD20單克隆抗體(mAb)以B細胞表面分子CD20為靶向，用于治療B細胞淋巴瘤，具有療效。

慢性蕁麻疹是一種常見皮膚病，目前治療效果不佳。

發明內容

本發明的任務是提供一種表達后具有細胞結合活性、有效安全的用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法。

本發明通過下述技術方案來實現：

一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于：所述用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體包括以下步驟：：

A.??從雜交瘤細胞中擴增抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區基因和重鏈可變區基因；

B.??從293E細胞中擴增人抗體的輕鏈恒定區基因和重鏈恒定區基因；

C.??將經步聚A擴增后的抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區基因、重鏈可變區基因分別與經步聚B擴增后的人抗體的輕鏈恒定區基因、重鏈恒定區基因連接，得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈CD20嵌合抗體基因；

D.?將步聚C中得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈CD20嵌合抗體基因分別克隆到PTY5真核表達載體。

本發明進一步的改進方案包括：

所述步聚A的具體方法是：以雜交瘤細胞的cDNA為模板，用引物V_L-F和V_L-R擴增輕鏈可變區基因，用引物V_H-F和V_H-R擴增重鏈可變區基因，其中

V_L-F的基因序列：5'-CGGAATTCatggattttcaggtgcagattatc-3'，為EcoRI酶切位點，

V_L-R的基因序列：5'-CCTCCGAAtttgatttccagcttggtcccc-3'，為重疊片段，

V_H-F的基因序列：5'-CGGAATTCatgggttggagcctcatcttgc-3'，為EcoRI酶切位點，

V_H-R的基因序列：5'-CCTTGGCCagagacggtgaccgtcccttg-3'，為重疊片段；

所述步聚B的具體方法是：以293E細胞的cDNA為模板，用引物C_L-F和C_L-R擴增輕鏈恒定區基因，用引物C_H-F和C_H-R擴增重鏈恒定區基因，其中

C_L-F的基因序列：5'-AAATCAAAttcggaggggggaccaaggtg-3',為重疊片段，

C_L-R的基因序列：5'-CGGGATCCtcaacactctcccctgttgaag-3'，為BamHI酶切位點，