[發(fā)明專利]一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310477885.X
• 申請日: 2013-10-14
• 公開（公告）號: CN103525823A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱慧蘭;李潤祥;梁碧華;李振潔;龔業(yè)青;馬少吟;高愛莉
• 申請（專利權(quán)）人: 朱慧蘭
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/79;C07K16/46;C07K16/28;A61P17/00
• 代理公司: 廣州市一新專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44220
• 代理人: 王德祥

1.一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

從雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因；

從293E細(xì)胞中擴(kuò)增人抗體的輕鏈恒定區(qū)基因和重鏈恒定區(qū)基因；

將經(jīng)步聚A擴(kuò)增后的抗鼠CD20抗體的輕鏈可變區(qū)基因、重鏈可變區(qū)基因分別與經(jīng)步聚B擴(kuò)增后的人抗體的輕鏈恒定區(qū)基因、重鏈恒定區(qū)基因連接，得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈CD20嵌合抗體基因；

將步聚C中得到輕鏈CD20嵌合抗體基因和重鏈CD20嵌合抗體基因分別克隆到PTY5真核表達(dá)載體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于：所述步聚A的具體方法是：以雜交瘤細(xì)胞的cDNA為模板，用引物V_L-F和V_L-R擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因，用引物V_H-F和V_H-R擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因，其中

V_L-F的基因序列：5'-CGGAATTCatggattttcaggtgcagattatc-3'，為EcoRI酶切位點(diǎn)，

V_L-R的基因序列：5'-CCTCCGAAtttgatttccagcttggtcccc-3'，為重疊片段，

V_H-F的基因序列：5'-CGGAATTCatgggttggagcctcatcttgc-3'，為EcoRI酶切位點(diǎn)，

V_H-R的基因序列：5'-CCTTGGCCagagacggtgaccgtcccttg-3'，為重疊片段；

所述步聚B的具體方法是：以293E細(xì)胞的cDNA為模板，用引物C_L-F和C_L-R擴(kuò)增輕鏈恒定區(qū)基因，用引物C_H-F和C_H-R擴(kuò)增重鏈恒定區(qū)基因，其中

C_L-F的基因序列：5'-AAATCAAAttcggaggggggaccaaggtg-3',為重疊片段，

C_L-R的基因序列：5'-CGGGATCCtcaacactctcccctgttgaag-3'，為BamHI酶切位點(diǎn)，

C_H-F的基因序列：5'-CCGTCTCTggccaagggaccacggtcac-3'，為重疊片段，

C_H-R的基因序列：5'-CGGGATCCtcatttacccggagacagggag-3'，為BamHI酶切位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于：所述步聚C中通過重疊延伸PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增后的輕鏈可變區(qū)基因和擴(kuò)增后的輕鏈恒定區(qū)基因的連接，以及實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增后的重鏈可變區(qū)基因和擴(kuò)增后的重鏈恒定區(qū)基因的連接，得到CD20嵌合抗體。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于：所述步聚D的具體方法為：將輕鏈基因、重鏈基因分別用內(nèi)切酶EcoRI、內(nèi)切酶BamHI進(jìn)行雙酶切，分別克隆到用同樣酶進(jìn)行雙酶切的載體pTY5中，構(gòu)建成重組表達(dá)載體，輕鏈基因、重鏈基因構(gòu)建成的重組表達(dá)載體分別為pTY5-CD20H和pTY5-CD20L。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于：所述雜交瘤細(xì)胞的cDNA和所述293E細(xì)胞的cDNA通過下述方法得到：分別提取雜交瘤細(xì)胞和293E細(xì)胞的細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，-20℃保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于：所述CD20嵌合抗體通過protein?A柱親和層析，得到高純度的抗CD20嵌合抗體。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于治療蕁麻疹的CD20嵌合抗體的制備方法，其特征在于：所述雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)于改良型快速雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中；所述293E細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，DMEM培養(yǎng)基中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和雙抗；雜交瘤細(xì)胞和293E細(xì)胞均培養(yǎng)于37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中CO₂的體積濃度為5%。