[發明專利]一種發酵法制備棘白菌素B的方法及菌株

有效

• 申請號: 201310477670.8
• 申請日: 2013-10-12
• 公開（公告）號: CN103555591A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 鄭裕國;鄒樹平;牛坤;鐘偉;毛健;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P21/04;C12R1/66
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一株構巢曲霉菌突變株——構巢曲霉（Aspergillus?nidulans）ZJB09223，以及利用所述的構巢曲霉ZJB09223發酵法制備棘白菌素B的方法。

（二）背景技術

棘白菌素B(Echinocandin?B)是一種具有環狀六肽核心和脂肪酸側鏈結構天然環狀脂肽類化合物。化學名是，分子式為C₅₂H₈₁N₇O₁₆，分子量為1060，結構式如下：

近年來，由于器官移植手術導致免疫抑制劑的大量使用，化療和更具侵襲性的醫療方法的應用等多種原因造成免疫低下患者增多，真菌感染發病率顯著升高，尤其是深部真菌感染的發病率和病死率逐年增加。棘白菌素類抗真菌抗生素是由相似的環狀多肽核心和不同的脂肪酸側鏈組成，是臨床治療系統性真菌感染的新一代抗真菌藥物。這類抗生素能夠非競爭性地抑制真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性。其作用機制獨特，毒副作用低，且對一些唑類和兩性霉素B耐藥的真菌具有很強的抗菌活性，尤其是對諸如曲霉和白念珠菌等呈現上升趨勢的真菌具有獨特的療效。目前已經有3種棘白霉素類藥物上市，即默沙東公司開發的卡泊芬凈（caspofungin），藤澤藥業開發的米卡芬凈（micafungin），以及輝瑞公司開發的阿尼芬凈（anidulafungin）。

阿尼芬凈（anidulafungin）具有抗各種念珠菌病的活體內和活體外活性的功效。在2005年的ICAAC會議上發表的研究表明：阿尼芬凈與氟康唑比較用于治療念珠菌血癥和侵入性念珠菌病。患者被隨機接受靜脈注射的阿尼芬凈100mg/d或靜脈注射的氟康唑400mg/d。在10或更多天的靜脈注射治療后，任一組的患者被轉到口服的氟康唑。研究結果證明接受阿尼芬凈患者的整體成功率高于使用氟康唑的患者。2006年2月21日，由輝瑞公司生產的阿尼芬凈通過了美國FDA認證，用于治療食管感染和其他形式的念珠菌感染。

目前，國外生產阿尼芬凈的路線，首先由構巢曲霉（Aspergilus?nidulans）發酵形成先導化合物棘白菌素B，通過脫酰基酶酶解除掉側鏈，然后經過化學修飾獲得。但是由于棘白菌素B發酵單位較低等多種因素，造成阿尼芬凈生產難度大、成本高，從而導致價格高昂且產量遠遠不能滿足國際市場的需求，是國際市場緊缺的醫藥原料之一。

由于商業利益的原因，國外的一些菌種和工藝等關鍵技術對外保密，很少公開報道。美國禮來公司自從上世紀80年代以來，進行多年的棘白菌素B發酵工藝條件優化和產物提取工作，但發酵產量一直沒有較大突破。在國內，盡管已有制取棘白菌素B的菌種，但是該菌株制取棘白菌素B的能力較弱，效能低。因此，選育出一株高產棘白菌素B的菌株對實現棘白菌素B產業化生產具有較大的社會和經濟效益。

（三）發明內容

本發明目的是提供一株棘白菌素B的高產菌株，以及采用該菌株發酵法制取棘白菌素B的方法，以克服現有棘白菌素B發酵技術中發酵周期長、單位產量低的缺陷。

本發明采用的技術方案是：

一株構巢曲霉菌突變株——構巢曲霉（Aspergillus?nidulans）ZJB09223，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏編號為CCTCC?NO：M?2012300，保藏日期為2012年07月25日。本發明突變株用于發酵制備棘白菌素B，發酵單位可達到3000mg/L以上。

本發明突變菌株由如下步驟獲得：

1)對構巢曲霉Aspergillus?nidulans（ATCC58397）進行LiCl/紫外/亞硝酸鈉復合誘變處理，涂布斜面，培養，得誘變處理突變株；

2）分別將步驟1）所得的突變株斜面培養物制備孢子懸液，涂布含有棘白菌素B的固體平板，培養，即得耐受棘白菌素B的構巢曲霉菌；

3）分別挑取步驟2）所得耐受棘白菌素B的構巢曲霉菌單菌落進行搖瓶發酵培養，檢測發酵物中的棘白菌素B產量，選擇棘白菌素B高產菌株，得到了Aspergillus?nidulans突變菌株ZJB09223。

本發明還涉及一種利用所述的構巢曲霉ZJB09223發酵法制備棘白菌素B的方法，所述方法包括：

（1）種子培養：將構巢曲霉ZJB09223接種至種子培養基，25～30℃培養24～48h，獲得種子液；所述種子培養基組成如下：葡萄糖0.5～1.5%，甘油0.5～5%，棉籽粉1～10%，溶劑為蒸餾水，pH值自然；