[發(fā)明專利]一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310473978.5
• 申請日: 2013-10-11
• 公開（公告）號: CN103498000A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王雪艷;陸雯;潘潞琪;姚含笑
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/64;C12R1/01
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 沈自軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病原菌檢驗檢疫領(lǐng)域，具體涉及一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組及試劑盒和方法。

背景技術(shù)

水稻是最重要的糧食作物，世界上一半人口以水稻為生。隨著水稻種質(zhì)資源的調(diào)運(yùn)日益頻繁，一些水稻病害隨種子調(diào)運(yùn)而嚴(yán)重擴(kuò)散，對稻米產(chǎn)量造成了不可挽回的損失。因此，重視并加強(qiáng)檢驗檢疫工作，對切實保障稻米生產(chǎn)安全及產(chǎn)地生態(tài)安全有著重要的意義。此外，我國加入WTO后，在植物出入境檢疫方面亦面臨著空前的挑戰(zhàn)。為確保我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，必須一方面有效制止病蟲害傳入我國，另一方面則要保證我國出口的農(nóng)產(chǎn)品符合進(jìn)口國的要求。而這些檢疫、防疫工作的落實則依賴靈敏、準(zhǔn)確以及便捷的病原檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

2007年，農(nóng)業(yè)部匯同國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局共同制定了《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，該目錄中明確規(guī)定水稻白葉枯病（Rice?bacterial?leaf?blight）、水稻細(xì)菌性條斑病（Rice?bacterial?leaf?streak）和水稻細(xì)菌性谷枯病（Bacterial?grain?rot）為水稻的檢疫性病害。由于帶菌種子是這三種病害的主要初侵染源與傳播途徑，因此及早檢測發(fā)現(xiàn)種子上的病原菌及有無癥狀病害，對于預(yù)防及采取相應(yīng)措施加以防治、指導(dǎo)生產(chǎn)、減少經(jīng)濟(jì)損失等均有著重要的意義。

現(xiàn)階段已有許多技術(shù)應(yīng)用到對水稻白葉枯病、細(xì)菌性條斑病和細(xì)菌性谷枯病的檢驗檢疫，例如經(jīng)典的產(chǎn)地檢驗、育苗生長觀察法、選擇性分離、噬菌體檢測、致病性測定、免疫分離、血清學(xué)檢測技術(shù)等，但主要還是依據(jù)三種病原菌的生理生化差異來區(qū)分。根據(jù)《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于水稻白葉枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢測方法規(guī)定，對于出入境種子首先需要進(jìn)行樣品的清洗、研磨并獲得提取液，然后進(jìn)行SPA的平板培養(yǎng)，或利用ELISA試劑盒對提取液進(jìn)行快速篩選檢測。對于檢測結(jié)果呈陽性的還需進(jìn)行進(jìn)一步的平板分離和生化鑒定。整個過程程序復(fù)雜，耗時長，且仍有可能造成假陽性。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)已廣泛用于水稻白葉枯病、細(xì)菌性谷枯病和細(xì)菌性條斑病的檢測（TakeuchiT,Sawada?H,Suzuki?F,et?a1.Specific?detection?of?Burkholderia?plantarii?and?B.glumae?by?PCR?using?primers?selected?from?the16S-23S?rDNA?spacer?regions[J].The?Phytopathological?Society?of?Japan,1997,63(6):455—462.；Cottyn?B,Bautista?A?T,Nelson?R?J,et?al.Polymerase?chain?reaction?amplification?of?DNA?from?bacterial?pathogens?of?rice?using?specific?oligonucleotide?primers.Int?Rice?Notes,1994,19:30～32.；Gnanamanickam?S?S,Sakthivel?N,Nelson?R?J,et?al.Evaluation?of?Culture?Media?and?Molecular?Probesfor?Detection?of?Xanthomonas?oryzae?pv.oryzae?in?Rice.In:Verma?J?P,Varma?A,KUMAR?D,ed.Detection?of?Plant?Pathogens?and?Their?Management.New?Delhi:Angkor?Publishers,1995,336～349.；張華，姜英華，胡白石，等.利用PCR技術(shù)專化性檢測水稻細(xì)菌性條斑病菌.植物病理學(xué)報，2008，38(1):1～5.；懷雁，等.水稻細(xì)菌性谷枯病菌的實時熒光PCR檢測技術(shù)研究.中國水稻科學(xué)，2003,23(1):107～110.；張華，胡白石，劉鳳權(quán).雙重PCR技術(shù)檢測水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌.植物檢疫，2007,21增刊）。

但是，現(xiàn)有技術(shù)只能對水稻白枯葉病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病原菌和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌中的一種或兩種進(jìn)行檢測鑒定，能同時對這三種病原菌進(jìn)行檢測鑒定的方法仍未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種多重PCR法檢測水稻檢疫性病原菌的引物組，利用該引物組可以同時對水稻白枯葉病原菌、水稻細(xì)菌性條斑病原菌和水稻細(xì)菌性谷枯病原菌這三種病原菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測鑒定。