[發明專利]一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201310473741.7
• 申請日: 2013-10-12
• 公開（公告）號: CN103642767A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 咸漠;曹玉錦;劉煒;王紀明
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N1/21;C12N15/70;C12P5/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶突變體，以及利用該突變體構建重組菌發酵生產異戊二烯的方法。

背景技術

異戊二烯又名2-甲基-1,3-丁二烯，是一種共軛二烯烴，易自身聚合，也易與其它不飽和化合物共聚合，因此，異戊二烯是一種重要的合成橡膠單體。在工業上，可被齊格勒-納塔催化劑催化聚合合成聚異戊橡膠，即天然橡膠；異戊二烯還可以用作合成丁基橡膠的一種共聚單體，以改進丁基橡膠的硫化性能。此外，異戊二烯在農藥、醫藥、香料及粘結劑等領域也有廣泛的應用。

目前，異戊二烯的主要來源是石油裂解精餾，是碳五餾分的重要組分。碳五餾分組成復雜，直接精餾難以得到純度較高的異戊二烯產品，通常采取萃取精餾及共沸精餾法由裂解碳五餾分中分離高純度異戊二烯，增加了異戊二烯的生產成本。除碳五餾分分離得到異戊二烯外，工業上還采用合成法生產；例如采用碳五以下的有機原料，如丙烯、異丁烯、甲醛、丙酮和乙炔來合成。隨著石化資源的枯竭，研究者們開始尋找新的異戊二烯生產方法，利用微生物轉化可再生的生物質資源生成異戊二烯，因其可再生型和對環境友好型，是一條具有潛在應用前景的途徑。

生物體內有兩條途徑合成異戊二烯，MVA途徑和MEP途徑。MVA途徑存在于真核生物及古細菌中，而MEP途徑主要存在于植物質體、真菌和各種細菌中。到目前為止，采用生物法合成異戊二烯的最有產量是通過MVA途徑實現的，美國的Genercor公司在工程大腸桿菌中利用MVA途徑進行異戊二烯合成，最高產量可以達到60g/L以上（美國發明專利：2009/0203102）；通過MEP途徑合成異戊二烯的報道產量目前都還比較低（Zhao?et?al.,Applied?Microbiology?and?Biotechnology,2011,90(6):1915-22）。然而，與MVA途徑相比，MEP途徑具有更高的理論產量，其產量較低推測是由于該途徑中的關鍵酶活性不高的原因造成的。

2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶催化MEP生成2-甲基-4-二磷酸胞苷赤蘚糖醇（CDP-ME）（圖1），是MEP途徑中的關鍵反應。在大腸桿菌中，該酶是一個同源二聚體，由ispD基因編碼，其結構已經得到了解析（Kemp?et?al.,Acta?Crystallographica?Section?D,2003,59:607）。本發明通過采用易錯PCR技術對該酶進行定點突變，獲得了改性的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶，并整合到完整的MEP途徑中，在發酵水平提高了異戊二烯的產量。

發明內容

本發明提供了一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶突變體，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶氨基酸序列第13位由Pro突變為Ala。

本發明提供了一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶突變體，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶氨基酸序列第20位由Arg突變為Lys。

本發明提供了一種2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶突變體，是2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶氨基酸序列第13位由Pro突變為Ala，第20位由Arg突變為Lys。

本發明采用易錯PCR的手段對大腸桿菌的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶進行突變，并結合下游合成β-胡蘿卜素的途徑進行篩選，獲取了較之大腸桿菌（Escherichia?coli?K-12?MG1655）原始2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶催化活性明顯提高的酶。

所述2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明專利還提供了采用2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶突變體增強大腸桿菌合成異戊二烯能力的方法。

利用突變后的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶提高異戊二烯合成能力的方法還包括：（a）將突變后的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶突變體連接原核表達載體；（b）將該表達載體導入大腸桿菌感受態細胞與大腸桿菌已有的MEP途徑相整合；（c）利用導入該2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶的重組大腸桿菌發酵合成異戊二烯。

本發明所提供的利用突變后的2-甲基赤蘚糖醇4-磷酸胞苷酰轉移酶提高異戊二烯合成能力的宿主細胞，優選大腸桿菌（Escherichia?coli?BL21(DE3)）。

有益效果：