[發明專利]豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201310472881.2
• 申請日: 2013-10-11
• 公開（公告）號: CN103499693A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 聶福平;楊俊;王昱;李賢良;李應國;肖進文
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明涉及豬瘟病毒抗體的免疫學檢測，具體涉及一種豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

豬瘟病毒（CSFV）屬于黃病毒屬的成員。由于CSFV的高致病力和高致死率，它已給養殖業造成了巨大的損失。豬感染高致病力毒株后在潛伏期即可造成感染，經歷急性豬瘟或亞急性豬瘟臨床癥狀的豬在出現癥狀前大量排毒，而耐過后的豬只體內有明顯的CSFV抗體，且不再排毒。感染溫和性毒株的豬呈慢性感染，在病死前會長期或間歇性地排毒。懷孕母豬可以通過胎盤感染胎兒導致流產、木乃伊化或產出弱豬、畸形胎等。先天性感染低毒力病毒的結果是產出持續性感染的仔豬，仔豬出現免疫耐受，不表現任何癥狀向外排毒。豬也有可能感染BVDV或BDV。盡管這些感染通常呈溫和過程并且是自限性的，但有效的將它們同豬瘟病毒區分是很重要的。我國自首次分離到該病毒以來，已先后在廣東、上海、福建等多省暴發和流行，目前該病在我國已普遍存在。現有的檢測方法主要有病毒的分離鑒定、免疫過氧化物酶技術，免疫膠體金技術，免疫熒光抗體染色技術，ELISA、PCR和real?time?PCR等，各有優缺，且特異性差異較大。同時，方法對樣品和人員的要求較高。由于豬感染豬瘟病毒或免疫豬瘟疫苗均能產生相應的抗體，且抗體能較好的反應其免疫或感染病毒的情況，因此，可以通過檢測CSFV的抗體來反應其免疫感染病毒情況。

AlphaLISA技術主要依賴于Alpha供體微珠和受體微珠的相互作用。當生物反應使供體微珠和受體微珠相互接近時,?激光激發級聯反應，從而產生極大放大的信號。具體來說，在680nm?的激光照射下,?供體微珠上的光敏劑將周圍環境中的氧氣轉化為更為活躍的單體氧。單體氧擴散至受體微珠，產生一系列的化學發光反應，最后將能量傳遞到銪，發射波長為615nm。在生物分子不存在特異的互相作用時，單體氧無法擴散到受體微珠，則不會有信號的產生。AlphaLISA技術憑借一種專有的基于微珠的技術，將傳統的ELISA?轉化為均相的“無需洗滌”的檢測。

AlphaLISA技術所使用的稀土元素銪（Eu），發射波長非常尖銳，為615nm，從而大大減少了檢測樣品中雜質的干擾，可直接檢測復雜樣品（血清和體液）中的生物分子。在臨床上，這非常適合測定人和動物的血清和體液樣本。而此技術的高通量、高靈敏度、操作簡便，能更準確、更省時的測定細胞因子等生物標志物。目前，已廣泛用于藥物篩選、細胞因子、病變基因、血清抗體等的檢測。

中國發明專利申請（申請號為：201210031802.X，201210047016.9）分別公開了采用AlphaLISA技術檢測腸道病毒71型衣殼蛋白（Anti-EV71?VP1?IgM）和甲型肝炎病?IgM?的方法。但是，目前尚無利用AlphaLISA技術檢測豬瘟病毒抗體的試劑盒及檢測方法的報道。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，以及編碼試劑盒中抗原的基因及其擴增該基因所用的引物。第二目的是提供一種用于食品安全檢測的豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測方法。

為實現第一目的本發明采用的技術方案是豬瘟病毒抗體競爭AlphaLISA檢測試劑盒，包括供體微珠、受體微珠、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體和帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原。

其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PE,AS101D?(即Nickel?chelate?Donor?beads(PE,AS101D))，濃度為80μg/mL，500μL；所述受體微珠為抗鼠IgG受體微珠，PE,AL105C（即Anti-mouse?IgG?Acceptor?beads(PE,AL105C)）?，濃度為80μg/mL，500μL；所述帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有與豬瘟病毒E2蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。

前述的試劑盒，包括供體微珠80μg/mL、受體微珠80μg/mL、豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體100nM/L及帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原180nM/L；使用時，以總體積20μL計，每孔添加量為：受體微珠4μL、供體微珠5μL、180nM/L帶His標簽的豬瘟病毒E2蛋白抗原?5μL、100nM/L?豬瘟病毒抗E2蛋白單克隆抗體5μL及待測樣品1μL。