[發明專利]一種對蝦白斑癥病毒雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310472419.2
• 申請日: 2013-10-11
• 公開（公告）號: CN103497250A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 戰文斌;唐小千;繩秀珍;劉鹿山;邢婧
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C12N5/20;G01N33/577
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸

技術領域

本發明涉及一種病毒檢測試劑盒，特別涉及一種用于檢測對蝦白斑癥病毒（WSSV）的雙抗體夾心ELISA試劑盒，屬于免疫學和病毒學交叉技術領域。

背景技術

對蝦白斑癥病毒（WSSV）為線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（whispovirus）唯一的成員，是一種具囊膜、桿狀的雙鏈DNA病毒，可廣泛感染蝦、蟹等十足類甲殼動物。WSSV主要侵染皮下組織、造血組織、結締組織、淋巴器官等，受感染的組織細胞核腫大，患病對蝦典型癥狀是甲殼內側具有大小不等的白色斑點，頭胸甲易被剝離。對蝦一旦感染該疾病，數天內死亡率可達100%，使對蝦養殖業遭到極大的損失。該病自上個世紀90年代開始流行于亞洲地區，并迅速蔓延至歐洲乃至全世界，給世界對蝦養殖業帶來了嚴重災難。目前該病缺乏切實有效的治療手段，因此建立WSSV快速、準確、簡便、靈敏、可定量的檢測方法，及時掌握養殖蝦、蟹類感染WSSV的嚴重程度，并積極采取相應的預防措施，對指導養殖生產具有重要意義。

目前常用的WSSV檢測方法有普通PCR、膠體金免疫層析試紙條和酶聯免疫法、實時熒光定量PCR等。普通PCR靈敏度較高，但是操作復雜，不能定量檢測；膠體金免疫層析試紙條能夠在幾分鐘內得到檢測結果，但是其靈敏度不高，且不能定量檢測；實時定量PCR的靈敏度很高，能夠定量檢測，但其設備昂貴、操作復雜。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種特異性強、靈敏度高、操作簡便、快速可定量的WSSV雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒。

本發明的另一個目的是提供用于上述雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的單克隆抗體，以及提供利用所述檢測試劑盒檢測對蝦白斑癥病毒的方法。

本發明的檢測試劑盒包括：包被捕獲抗體的酶標板，封閉液，洗滌液，堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG抗體、底物顯色液，終止液以及檢測抗體。

所述捕獲抗體是兔抗WSSV多抗。

所述檢測抗體鼠抗WSSV單抗。

所述封閉液是含質量體積比為3.0%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。

所述洗滌液是含質量體積比為0.1%?Tween-20的磷酸鹽緩沖液。

所述底物顯色液是對硝基酚磷酸二鈉（PNPP）底物顯色液，其含1mg/m的pNPP、0.5mol/L的氯化鎂以及體積比為10%的二乙醇胺。

所述終止液是2?mol/L的NaOH水溶液。

所述作為捕獲抗體的兔抗WSSV多抗的制備方法如下：

將純化的WSSV與弗氏完全佐劑充分混勻后，皮下多點注射新西蘭大白兔；2周后將WSSV與弗氏不完全佐劑混勻，皮下多點注射進行加強免疫；接下來每隔1周進行1次加強免疫，采用皮下多點注射提純的WSSV；第3次加強免疫后6天收集抗血清，兔抗血清經過辛酸-硫酸銨法純化后即為捕獲抗體。

所述作為檢測抗體的鼠抗WSSV單克隆抗體由名稱為：雜交瘤細胞WSSV-3B7，保藏編號為CCTCC?NO:?C201398，保藏單位為：中國典型培養物保藏中心，保藏日期為：2013年06月24日的雜交瘤細胞分泌所得。

在倒置顯微鏡下觀察，生長狀態良好的該雜交瘤細胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、折光性強、細胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細胞有無限分裂增生能力；長勢良好的該雜交瘤細胞常規培養2-3天，其培養基由桃紅色轉變為黃色，該培養基中含有該雜交瘤細胞分泌的大量的抗WSSV單克隆抗體。

利用所述WSSV雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒檢測對蝦白斑癥病毒的方法，其步驟如下：

（1）加待檢樣品：取試劑盒中包被有捕獲抗體的酶標板，向其中加入經過處理的待檢樣品，每孔100?μL，每個樣品3個重復，37?℃孵育1?h；

（2）檢測抗體孵育：棄去板內液體，洗滌酶標板，每孔加入100?μL檢測抗體，37?℃孵育1?h；

（3）酶標二抗孵育：棄去板內液體，洗滌酶標板，每孔加入100?μL堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG抗體，37?℃孵育1?h；

（4）顯色與OD測定：棄去板內液體，洗滌酶標板，每孔加入200?μL底物顯色液，37?℃條件下孵育發色15?min，每孔加入50?μL?2?mol/L的NaOH溶液終止反應，用酶標儀測定OD₄₀₅值；