[發明專利]分枝桿菌快速藥敏檢測方法及檢測靶標

有效

• 申請號: 201310471718.4
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103555828A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 崔振玲;胡忠義;程松;張長明;于明輝
• 申請（專利權）人: 上海市肺科醫院;上海仁度生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 竺路玲

技術領域

本發明涉及一種分枝桿菌的檢測方法和檢測靶標，尤其涉及一種所需細菌少、檢測時間短、操作方便的藥敏檢測方法和靶標。

背景技術

分枝桿菌是一類細長略彎曲的微生物，主要種類包括結核分枝桿菌、非典型分枝桿菌、腐物寄生性分枝桿菌和麻風分枝桿菌等，其中含有多種致病菌。分枝桿菌不產生內、外毒素，致病性可能與細菌在組織細胞中大量繁殖引起的炎癥、菌體成分和代謝物質的毒性以及對菌體成分產生的免疫損傷有關。其中，麻風病目前并沒有特異性的預防方法，而結核病自20世紀80年代以來由于與HIV混合感染、移民以及耐藥菌株的出現而全面復活。

中國是22個結核病高發國家之一，而且中國結核病人中攜帶耐藥菌株的患者占28%-40%，遠高于其它國家，耐藥結核菌株的增加給結核病的防治帶來極大困難。目前結核的治療仍然以抗結核藥物化學治療為主，但是近年來對一種或多種抗結核藥物同時耐藥的菌株（多耐藥菌）明顯增多，因此準確的藥敏實驗結果對于指導臨床治療和合理用藥至關重要。

分枝桿菌藥敏檢測已有諸多報道，目前分枝桿菌藥敏實驗多采用絕對濃度法和比例法（全國臨床檢驗操作規程第三版），如CN102010886A公開的結核分枝桿菌藥敏檢測方法。但是分枝桿菌生長緩慢，在傳統羅氏（L-J）培養基上，需要4-8周才能生長出菌落，在經4周后才能得到藥敏結果。

CN101130808B采用連續超千倍放大系統在早期培養過程中，觀察單個細菌的增殖和微小菌簇的增殖形態，從而可以早期判斷藥物作用的結果，但是該方法依然需要一周的時間獲得藥敏結果。

目前，PCR、探針雜交、DNA測序等分子生物學方法已應用于分枝桿菌的直接檢測，DNA檢測時基因突變檢測的金標準，但是檢測成本過高，DNA芯片檢測在理論上可以對樣品大量序列進行檢測和分析，但是目前尚未見到有適用于臨床的DNA芯片實現商業化。實驗室研究以及臨床檢測所用的核酸定量擴增檢測方法主要以實時熒光定量PCR為主，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測反應進程，通過標準曲線進行定量分析。但是實時熒光定量PCR檢測在操作方法和檢測成本上存在很大局限性，CN1661359B公開了一種核酸等溫擴增定量檢測方法，將等溫放大與TaqMan或TaqMan?MGB熒光探針結合，該專利提出用逆轉錄酶的外切酶的酶活性降解所述熒光探針產生的應該信號。CN101333565B公開了一種將核酸恒溫放大與檢測同步進行的檢測方法，在密閉容器中進行恒溫放大反應，并同時檢測體系中熒光信號的變化，根據熒光信號的變化時間和強度對核酸樣品進行定量或定性檢測。

但是具體到分枝桿菌的藥敏檢測，找到有效的檢測靶標是進行藥敏檢測的根本和基礎。

發明內容

本發明所要解決的是尋找分枝桿菌藥敏檢測靶標、并在此基礎上進行快速藥敏檢測的問題。

本發明的目的在于提供一種分枝桿菌快速藥敏檢測方法及靶標。

本發明的第一個方面提供了一種用于分枝桿菌快速藥敏檢測的靶標，所述靶標選自一種或幾種核糖體RNA的間隔序列。

其中，所述核糖體RNA的間隔序列優選為選自5s?rRNA與16s?rRNA之間的間隔序列（pre-16s?RNA）、16s?rRNA與23s?rRNA之間的間隔序列（pre-23s?RNA）、及含有此部分序列全部或者部分的序列中的任意一種作為擴增或者檢測靶標。

本發明第二個方面是提供一種分枝桿菌快速藥敏檢測方法，所述方法包括如下步驟：

以本發明第一個方面所述任意一種或幾種靶標RNA序列設計RNA探針和引物，在逆轉錄酶和RNA聚合酶的作用下，對靶標RNA進行RNA擴增，通過比較對照組和加藥組內靶標RNA量的差異，判斷藥物敏感性。

其中，所述的RNA探針的兩端優選為用熒光基團和淬滅基團進行標記。

其中，本發明所述的RNA探針優選為莖環結構。

其中，本發明所述的RNA引物，優選地，其中一條引物與所述靶標RNA序列相匹配，并且帶有T7啟動子；另一條引物為合成cDNA互補鏈的引物。

在本發明第二個方面所述的方法的一種優選實施例中，所述RNA擴增反應在40-45℃條件下進行，優選為41-44℃，更優選為42-43℃，最優選為42℃。

在本發明第二個方面所述的方法的一種優選實施例中，在所述RNA擴增過程中，每一次擴增循環檢測一次熒光信號，共檢測至少30個循環，優選為至少35個循環，更優選為至少40個循環。