[發(fā)明專利]蛹蟲草素在豬小卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310471237.3
• 申請日: 2013-10-06
• 公開（公告）號: CN103525759A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高妍;劉慧玉;張嘉保;張永宏;翟博;張連江;袁寶;權(quán)福實;劉殿峰
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12R1/91
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物發(fā)育學(xué)領(lǐng)域，涉及蛹蟲草素對豬小卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中的應(yīng)用，具體地說是蛹蟲草素對豬小卵泡卵母細(xì)胞在體外成熟的GVBD、MⅠ、MⅡ時期，對母源基因的腺苷酸化進(jìn)行不同程度的抑制作用，從而導(dǎo)致部分母源基因表達(dá)差異以及豬小卵泡卵母細(xì)胞體外成熟率的不同。

背景技術(shù)

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)、細(xì)胞核移植技術(shù)、胚胎干細(xì)胞技術(shù)研究的深入，進(jìn)一步推動了體外受精技術(shù)的迅速發(fā)展。然而卵母細(xì)胞數(shù)量有限，只有少量的卵母細(xì)胞應(yīng)用于胚胎移植技術(shù)研究，極大地限制了繁殖新技術(shù)的應(yīng)用。卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)不僅可以再現(xiàn)體內(nèi)受精過程，而且有利于受精機(jī)理的研究。卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)可以為體外胚胎移植技術(shù)提供大量廉價的胚胎，有利于推動細(xì)胞核移植、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)的發(fā)展。

在卵巢中卵泡的大小、卵母細(xì)胞的直徑與卵母細(xì)胞的體外成熟關(guān)系非常密切(Liu?et?al.2002;Lucas?et?al.2002;Griffin?et?al.2006)。許多研究結(jié)果表明，在非閉鎖卵泡中，隨著卵泡體積的增加，其卵母細(xì)胞的成熟率、受精率和囊胚發(fā)育率均隨之提高。Melanie?A.等（2007）的研究結(jié)果顯示，來自5-8mm卵泡的卵母細(xì)胞囊胚發(fā)育率幾乎是<3mm的小卵泡卵母細(xì)胞的三倍（55%比17%）。小卵泡卵母細(xì)胞作為能夠提供巨大資源卵泡卵母細(xì)胞在近幾年來越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。進(jìn)入九十年代以后，小卵泡卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)有了進(jìn)一步的發(fā)展。國內(nèi)外的眾多學(xué)者通過研究，建立了很多小卵泡卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)，然而這些技術(shù)大多在卵泡卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上建立起來的。對豬小卵泡卵母細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立較晚，直到1975年Tsafriri?A等首次取卵泡大小在1-2mm的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的成熟率只有15%～25%。

蛹蟲草素(cordycepin)又稱蟲草菌素、3’-脫氧腺苷（3’-dA），是蛹蟲草中（尤其是核苷類）主要活性成分，也是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素。在正常的卵母細(xì)胞成熟過程中基因表達(dá)控制主要是轉(zhuǎn)錄后水平，主要是受到細(xì)胞質(zhì)的多聚腺苷酸化的影響，這個過程對于保護(hù)mRNA不受降解及激發(fā)它們進(jìn)行翻譯起著重要的作用(Bettegowda?and?Smith,2007;Zhang?et?al.,2009)。3’-dA能夠通過脫腺苷化致使mRNA的降解(reviewed?in?Bettegowda?and?Smith,2007)。從而影響卵母細(xì)胞成熟的過程中mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，在早期胚胎發(fā)育時基因組激活之前或之后會影響mRNA的變性。Krischek和Meinecke(2002)研究表明，牛卵母細(xì)胞體外成熟需要母源基因的多聚腺苷酸化。因此對于大卵泡卵母細(xì)胞培養(yǎng)過程中，多聚腺苷酸化的抑制作用會導(dǎo)致成熟率以及成熟質(zhì)量的下降。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供蛹蟲草素在豬小卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：蛹蟲草素在豬小卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述豬小卵泡卵母細(xì)胞的收集方法是：卵巢采于剛屠宰母豬的卵巢，放入含75mg/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的37℃生理鹽水中，并在2小時之內(nèi)用生理鹽水清洗2～3次；在無菌操作室內(nèi)用18號針頭的注射器抽取直徑<3mm的小卵泡的卵母卵丘復(fù)合體，在顯微鏡下挑取有3～5層顆粒細(xì)胞包裹，細(xì)胞質(zhì)均勻，透明帶完整的卵丘卵母細(xì)胞(COCs)復(fù)合體。

一種豬小卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的方法，包括下列步驟：

（1）豬小卵泡卵母卵丘復(fù)合體的收集

卵巢采于剛屠宰母豬的卵巢，放入含75mg/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的37℃生理鹽水中，并在2小時之內(nèi)用生理鹽水清洗2～3次；在無菌操作室內(nèi)用18號針頭的注射器抽取直徑為<3mm卵泡的卵母卵丘復(fù)合體，在顯微鏡下挑取有3～5層顆粒細(xì)胞包裹，細(xì)胞質(zhì)均勻，透明帶完整的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體；

（2）豬小卵泡卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液的配制及培養(yǎng)

配制培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為TCM-199，平衡之前加入0.1%PVA(w/v)，3.05mM?D-葡萄糖,1mM丙酮酸鈉，0.57mM半胱氨酸,10ng/ml?EGF,10IU/ml?PMSG，10IU/ml?hCG，75mg/ml青霉素，50mg/ml鏈霉素，最后添加蛹蟲草素終濃度為2μg/ml；