[發明專利]表達IBV S1和N雙抗原蛋白重組質粒及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201310470341.0
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103627718A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 韋平;李孟;何坤
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于動物醫藥生物工程研究領域，尤其涉及一種表達IBV的S1和N雙抗原蛋白重組質粒及其構建方法和應用。?

背景技術

雞傳染性支氣管炎（infectious?bronchitis，IB）為國際獸醫局及我國規定的家禽二類傳染病之一，是目前分布最廣泛、發病最普遍的疫病之一。該病是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性的呼吸道疾病，不同日齡、性別、品種雞均可易感。IBV主要侵害雞的呼吸道、腸道、輸卵管及腎臟，可引起相應器官的病變和損傷，更重要的是容易引起細菌及其它病原的繼發感染，引起更大的損失，是造成目前生產上最普遍而且危害最大的雞呼吸道綜合癥的重要病因之一。由于IBV在雞群中感染的廣泛性和普遍性，加之病毒基因組RNA復制過程的不連續性以及RNA聚合酶的不完全校對機制，造成其基因組十分容易發生點突變、缺失、插入和不同毒株基因組間的同源重組，使得病毒的血清型、基因型、致病性、免疫原性等極易發生變異，因而病毒臨床表現復雜、血清型眾多，而各血清型之間僅有部分或完全沒有交叉保護作用，從而給本病的免疫防控帶來很大的困難。?

IBV有三個主要結構蛋白，即纖突（S）蛋白、膜（M）蛋白、核衣殼（N）蛋白。S蛋白由S1和S2兩個糖蛋白亞基組成，其中S1糖蛋白是IBV蛋白中變異程度最大的結構蛋白，系IBV的主要保護性抗原和致病相關基因，IBV的抗原性和致病性的改變主要與S1基因的變異有關。S1基因5'端起始密碼后第159～444nt處存在一個高變區（HVR），在HVR內第330～357nt處又存在一個所謂的相對保守處，因而將HVR分隔為上游的HVR?I和下游的HVRⅡ。大多IBV血清型抗原決定簇位于S蛋白的S1亞單位的N端，即S1的前300個氨基酸殘基內。那些遺傳起源接近血清型不同的毒株大多可從HVR區編碼的抗原簇表位的差異得到反映。N蛋白位于病毒的內部，相對于S1基因而言則比較保守，它在病毒復制及組裝過程中具有重要作用，而且具有很好的免疫原性，在體內可誘導產生高水平的抗體并介導細胞毒性T細胞效應（CTL）。防控IB的關鍵在于避免早期的感染，這樣能大大減少IBV對雞體的侵害。?

疫苗預防仍是控制IB的最有效措施之一，針對IB病毒的基因變異與血清型變化，怎樣使用疫苗來有效預防該病是我們當前迫切要解決的難題。現有的研究針對載體和佐劑的?單基因疫苗居多，研制能產生高的特異性細胞免疫和體液免疫且廣譜的新型疫苗仍是當前研究的難點和熱點。DNA疫苗具有一般重組病毒活載體疫苗抗原合成和提呈及類似自然感染的優點，其在安全性和有效性上具有突出的優點而且可以將多個抗原基因構建在同一表達載體上形成多價疫苗。但是，常規DNA疫苗的免疫原性較傳統疫苗弱，主要原因是大部分質粒在未發揮作用之前就降解了，而且表達的蛋白只有小部分能達到靶器官發揮免疫誘導作用。針對此問題，提高DNA疫苗效果的一個令人振奮的途徑是DNA疫苗的靶向策略，即將DNA疫苗或其表達的蛋白產物定向于抗原遞呈細胞（APC），特別是樹突狀細胞（DC）。APC內部靶向策略之一就是增強MHC-Ⅰ類途徑，使用微小基因疫苗將抗原表位直接轉運進內質網。?

泛素（Ubiquitin，Ub）是由76個氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細胞內的小分子多肽。泛素及其對蛋白質的標志修飾（泛素化，ubiquitination?or?ubiquityrmtion）參與細胞內ATP依賴的選擇性蛋白質降解過程，泛素-蛋白酶體途徑的發現，引起了研究者的廣泛關注。研究表明，26S蛋白酶體與主要組織相容性復合物（MHC）限制性類抗原的處理有密切關系，泛素-蛋白酶體途徑是MHC-Ⅰ限制性類抗原提呈所必需的環節。Ub可通過共價鍵結合將外源性抗原轉化為內源性抗原并促進內源性抗原在胞漿內的降解，有利于使抗原導向到蛋白酶體中，并且加速它的循環及通過MHC-Ⅰ類途徑的遞呈。近年來，國內外已有學者利用泛素來提高DNA疫苗的免疫效果，研究結果表明Ub融合質粒DNA能夠誘生較強的細胞免疫反應。目前關于泛素增強禽類病原免疫應答研究報道甚少，尤其是針對病毒抗原的研究還未見報道。?

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種表達IBV的S1和N雙抗原蛋白重組質粒及其構建方法和應用。?

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：表達IBV的S1和N雙抗原蛋白重組質粒，主要由雞傳染性支氣管炎病毒的S1、N基因、雞的Ub基因和真核表達載體pVAX1組成。?