[發(fā)明專利]水稻條紋病毒p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310470167.X
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103497956A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 燕飛;吳根土;楊勇;嚴成其;陳劍平
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/84;C12N1/21;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域及植物病害防治領(lǐng)域，尤其涉及水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)P3基因在植物抗白葉枯病中的應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)

水稻條紋病毒（Rice?Stripe?virus,?RSV）是由灰飛虱傳播的一種重要水稻病毒，由該病毒導(dǎo)致的水稻條紋葉枯病在我國持續(xù)發(fā)生，造成嚴重經(jīng)濟損失。近年來，我國科學(xué)家針對RSV的生物學(xué)和分子生物學(xué)研究開展了一系列細致而深入的工作：測定了病毒全基因組序列、鑒定了病毒沉默抑制蛋白、運動蛋白、開展了水稻互作蛋白的分離篩選工作、建立了灰飛虱飼毒、檢測技術(shù)、綜合防治技術(shù)等工作，這些工作所取得的進展加深了人們對于RSV致病機制的了解。RSV的p3基因編碼一個沉默抑制蛋白，通過與siRNA結(jié)合起到抑制RNA沉默的作用。

水稻白葉枯病（bacterial?blight）由黃單胞桿菌水稻變種（Xanthomonas?oryzae?pv.?oryzae）引起，是一種世界性的重要稻病，在全球各稻區(qū)幾乎均有發(fā)生。在我國，白葉枯病同紋枯病、稻瘟病被列為水稻三大病害，對我國水稻生產(chǎn)危害極大，一直是影響我國水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的一個嚴重性病害。據(jù)統(tǒng)計，在發(fā)病較重的年份和地區(qū)該病引起的水稻減產(chǎn)高達50%甚至絕收。

防治水稻白葉枯病的最經(jīng)濟有效的措施是選育和種植抗病品種。傳統(tǒng)的防治方法是通過不斷更換農(nóng)藥品種以及加大農(nóng)藥使用量來防治稻瘟病，這對生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生壓力。利用植物基因工程可向現(xiàn)有栽培品種中導(dǎo)入外源基因而不受種屬限制，拓展可利用基因的來源，為作物抗病育種工作開辟了一條嶄新而有效的途徑。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個目的是提供水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用。本發(fā)明的第一個目的是提供一種抗白葉枯病的水稻的制備方法。

為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用。該基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示。該基因來源于水稻條紋病毒，通過GenBank序列比對設(shè)計引物從我們田間采集的水稻病株上序列擴增而來。作為優(yōu)選，該基因用于制備抗白葉枯病水稻。

為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，該方法采用包含水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因的宿主細胞對水稻成熟胚進行的遺傳轉(zhuǎn)化獲得。作為優(yōu)選，所述的宿主細胞由包含水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因的植物表達載體轉(zhuǎn)化。作為再優(yōu)選，轉(zhuǎn)化菌株為農(nóng)桿菌菌株EHA105。

作為優(yōu)選，所述的宿主細胞的制備方法包括以下的步驟：

(1)?水稻條紋病毒p3基因的克隆及載體構(gòu)建

通過GenBank中的RSV?p3序列分析，設(shè)計如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴增得到水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因，該基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示，引物設(shè)計時已加入酶切位點，用于將p3基因重組到雙元表達載體pCV1300中；引物序列如下：

P3?(+):??5’-?T?TCTAGA?ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT?-3’

P3?(-):??5’-?G?GGATCC?CTACAGCACA?GCTGGAGAGCT?-3’；

(2)?轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

取-70?℃保存的EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)，置冰上融解；取1μl抽純pCV-P3-C質(zhì)粒加入到100?μl感受態(tài)中，混勻，加入到處理好的電擊杯；設(shè)置2200V電壓，電擊轉(zhuǎn)化；點擊完成加入900?μl的液體YEP培養(yǎng)基，28?℃，200?rpm搖床培養(yǎng)1.5?h，菌液涂布在含50?μg/ml卡那霉素和100?μg/ml利福平平板上，28?℃培養(yǎng)至形成單菌落。

作為優(yōu)選，所述的抗白葉枯病的水稻的制備方法包括以下的步驟：

1)?菌液的準備