[發(fā)明專利]水稻條紋病毒p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310470167.X
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103497956A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 燕飛;吳根土;楊勇;嚴(yán)成其;陳劍平
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/84;C12N1/21;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因用于制備轉(zhuǎn)基因抗白葉枯病植物體的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：該基因用于制備抗白葉枯病水稻。

3.一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于：該方法采用包含水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因的宿主細(xì)胞對水稻成熟胚進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化獲得。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于：所述的宿主細(xì)胞由包含水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于：轉(zhuǎn)化菌株為農(nóng)桿菌菌株EHA105。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于：所用載體為pCV1300-p3。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于宿主細(xì)胞的制備方法包括以下的步驟：

(1)?水稻條紋病毒p3基因的克隆及載體構(gòu)建

通過GenBank中的RSV?p3序列分析，設(shè)計如下引物用于從田間采集的RSV侵染水稻病株中擴增得到水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因，引物設(shè)計時已加入酶切位點，用于將p3基因重組到雙元表達(dá)載體pCV1300中，稱為pCV1300-p3；引物序列如下：

P3?(+):??5’-?T?TCTAGA?ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT?-3’

P3?(-):??5’-?G?GGATCC?CTACAGCACA?GCTGGAGAGCT?-3’；

(2)?轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

取-70?℃保存的EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)，置冰上融解；取1μl抽純pCV-P3-C質(zhì)粒加入到100?μl感受態(tài)中，混勻，加入到處理好的電擊杯；設(shè)置2200V電壓，電擊轉(zhuǎn)化；點擊完成加入900?μl的液體YEP培養(yǎng)基，28?℃，200?rpm搖床培養(yǎng)1.5?h，菌液涂布在含50?μg/ml卡那霉素和100?μg/ml利福平平板上，28?℃培養(yǎng)至形成單菌落。

8.根據(jù)權(quán)利要求3或5或7所述的一種抗白葉枯病的水稻的制備方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：

1)?菌液的準(zhǔn)備

取-70?℃保存的包含水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus,?RSV)p3基因的陽性轉(zhuǎn)化菌株，于含50?μg/ml卡那霉素和100?μg/ml利福平平板上劃線，28?℃培養(yǎng)至形成單菌落，挑取單菌落于含50?μg/ml?Kan、100?ug/ml?Rif的YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)24?h；將菌液按1:100用YEP?培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6；

2)?水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子；將種子放入100?ml無菌燒杯中，倒入70%酒精消毒1min，無菌水洗3-5遍，直到?jīng)]有酒精味道；加入50?ml?20%次氯酸鈉；溶液，浸泡30min；倒去次氯酸鈉溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍，最后一遍浸泡30min；種子放在無菌濾紙上吸干，置入成就胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿9-12顆；操作完畢用封口膜；封好培養(yǎng)皿，在28℃光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3周；在超凈工作臺上打開培養(yǎng)皿，用鑷子挑取自然分裂的胚性愈傷組織，置入繼代培養(yǎng)基中，在28℃光照培養(yǎng)箱，繼代培養(yǎng)1周；

3)?愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

收集菌體，用含200?μmol/L?As的AAM感菌液制成懸浮液，使菌液OD₆₀₀的終濃度為0.1；將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液侵染5min；將愈傷組織取出，置于無菌的濾紙上瀝干30-40min；將愈傷組織置于共培養(yǎng)基上；26℃暗培養(yǎng)2.5d；

4)?抗性愈傷的篩選與分化

將愈傷組織取出，用無菌水清洗1遍，再用含500?mg/L頭孢拉定或頭孢噻肟鈉的無菌水浸泡30?min，清洗3-5遍，置于無菌濾紙上瀝干2h；

隨后將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇，28℃，光照培養(yǎng)14d；將長有抗性愈傷的初始愈傷進(jìn)行第二輪選擇，28℃，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出；挑取顏色鮮黃的顆粒類抗性愈傷3-4顆，移入裝有分化培養(yǎng)基的塑料廣口瓶中，放入恒溫培養(yǎng)室中，等待分化成苗；

5)?生根壯苗和移載

當(dāng)抗性愈傷組織分化的芽長至約2?cm時，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周；選擇高10?cm、根系發(fā)達(dá)的小苗，洗去培養(yǎng)基，在溫室內(nèi)移栽入土。