[發明專利]基于TaqMan探針的環介導恒溫擴增法及其專用LAMP引物與試劑盒

有效

• 申請號: 201310469839.5
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103540660A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 劉威;黃留玉;袁靜;楊展;李環;崔茜
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術領域

本發明屬于生物技術領域中核酸的分子生物學檢測方法，特別是涉及一種基于Taqman探針的環介導恒溫擴增法及其在目的基因（核酸）檢測中的應用。

背景技術

實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、不需要PCR產物后處理，有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。

TaqMan熒光探針PCR技術是實時熒光定量PCR技術的一種，PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一條特異性的TaqMan熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′→3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。一分子的產物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此，Taqman探針檢測的是積累熒光。常用的熒光基團包括FAM、TET、VIC、HEX等。

2000年Notomi在Nucleic?Acids?Res雜志上公開了一種新的基因診斷技術，即LAMP(Loop-mediated?isothermal?amplification)，中文名為“環介導等溫擴增反應”，受到了世衛組織WHO、各國學者和相關政府部門的關注，短短幾年，該技術已成功地應用于SARS、禽流感、HIV等疾病的檢測中，在甲型H1N1流感事件中，日本榮研化學公司接受WHO的邀請進行H1N1LAMP試劑盒的研制。通過近十年的推廣，LAMP技術已廣泛應用于內各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進出口快速診斷中，并得到了歐美國家的認同。LAMP方法的優勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，結果的檢測也很簡單，不需要像PCR那樣進行凝膠電泳，LAMP反應的結果通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，適合基層快速診斷。

LAMP與以往的核酸擴增方法相比具有如下優點：

(1)操作簡單，LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，對于中小醫院只需要水浴鍋即可，產物檢測用肉眼觀察或濁度儀檢測沉淀濁度即可判斷。對于RNA的擴增只需要在反應體系中加入逆轉錄酶就可同步進行(RT-LAMP)，不需要特殊的試劑及儀器。

(2)快速高效，因為不需要預先的雙鏈DNA熱變性．避免了溫度循環而造成的時間損失．核酸擴增在lh內均可完成，添加環狀引物后時間可以節省1/2，多數情況在20-30min均可檢測到擴增產物。且產物可以擴增至10⁹倍，達0.5mg/mL．應用專門的濁度儀可以達到實時定量檢測。

(3)高特異性，由于是針對靶序列6個區域設計的4種特異性引物。6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，因此其特異性極高。

(4)高靈敏度，對于病毒擴增模板可達幾個拷貝，比PCR高出數量級的差異。

LAMP技術目前的檢測方法主要為以下幾種：一是普通電泳法，將LAMP擴增產物進行普通凝膠電泳，但此檢測方法無特異性，因為只要發生了LAMP反應，電泳條帶均一樣。二是熒光染色法，染料主要包括：SYBR?Green?I、羥基萘酚藍（Hydroxynaphthol?blue，HNB）、鈣黃綠素。但是，SYBR?Green?I染料只要擴增出核酸便顯示陽性，無特異性；羥基萘酚藍與鈣黃綠素均是指示LAMP的副產物鎂離子的變化，也無特異性。三是濁度法，此法主要是檢測LAMP的副產物焦磷酸鎂，焦磷酸鎂是一種白色沉淀，只要發生LAMP反應溶液即變渾濁，此法也無特異性。

綜合以上三種檢測方法，均不能對擴增產物進行特異檢測，均為間接檢測，這也就帶來了一個非常大的問題，如果LAMP發生了非特異性擴增，那么用這些檢測方法獲得的結果均是假陽性，因此，需要對LAMP技術進行改進，從根本上解決檢測結果假陽性的問題。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種基于Taqman探針的環介導恒溫擴增法及其專用LAMP引物和Taqman探針。