[發明專利]基于TaqMan探針的環介導恒溫擴增法及其專用LAMP引物與試劑盒

有效

• 申請號: 201310469839.5
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103540660A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 劉威;黃留玉;袁靜;楊展;李環;崔茜
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種基于Taqman探針的環介導恒溫擴增法的專用LAMP引物，是從美國基因數據庫GenBank檢索獲得待測目的基因的核苷酸序列，通過BLAST軟件進行同源性分析，找到特異性的LAMP保守靶序列，再根據LAMP保守靶序列設計LAMP引物。

2.根據權利要求1所述的專用LAMP引物，其特征在于：所述LAMP引物包括一條正向外引物F3、一條反向外引物B3、一條正向內引物FIP（FIP=F1c+F2）、一條反向內引物BIP（BIP=B1c+B2）。

3.根據權利要求1或2所述的專用LAMP引物，其特征在于：一種用在線LAMP引物設計軟件設計LAMP引物的方法，是先登錄LAMP引物設計軟件Primer?Explorer?V4的在線網站(http://primerexplorer.jp/e/)，然后導入LAMP保守靶序列，軟件自動生成LAMP引物，該軟件的具體使用方法，可包括以下步驟：

1）單擊瀏覽按鈕選擇靶基因序列文件，靶序列默認小于22kbp，支持三個類型的文件：普通文本格式（僅含序列）、FASTA格式和GenBank格式文件；

2）從下面三個選項中選擇定參數設定條件（引物設計條件），基于GC含量的自動判斷，起始的參數是特定的：如果GC含量小于或等于45％，則選取AT豐度高的區，如果GC含量高于60％，則選取GC豐度高的區,其它情況是標準設定狀態；

3）整理軟件自動設計出的LAMP引物，合成引物。

4.根據權利要求1或2或3所述的專用LAMP引物，其特征在于：當待測目的基因為NDM-1基因時，所述專用LAMP引物包括以下序列表示的引物組合：

正向外引物CJXJ1F3：5'-GCATAAGTCGCAATCCCCG-3'（序列表中序列2）；

反向外引物CJXJ1B3：5'-GGTTTGATCGTCAGGGATGG-3'（序列表中序列3）；

正向內引物CJXJ1FIP：5'-CTGGCGGTGGTGACTCACGAAAAGCATGCAGCGCGTCCA-3'（序列表中序列4）；

反向內引物CJXJ1BIP：5'-CGCGACCGGCAGGTTGATCAAAAGGTCGATACCGCCTGGAC-3'（序列表中序列5）。

5.一種基于Taqman探針的環介導恒溫擴增法的專用Taqman探針，其設計原則如下：

1）探針位置盡可能地靠近LAMP保守靶序列的兩端環狀位置，具體的來說就是探針的位置在F1和F3之間（將該探針命名為TF），或者B1和B3之間（將該探針命名為TB）；

2）探針長度在15-45bp（最好是20-30bp)之間；

3）檢測探針的DNA折疊和二級結構；

4）Tm值在60-65℃之間，GC含量在40％-70％之間；

5）探針的5’端避免使用G鳥嘌呤；

6）整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；

7）將設計好的序列在blast中核實一次，如果發現有非特異性互補區，需重新設計探針。

6.根據權利要求5所述的專用Taqman探針，其特征在于：所述TaqMan探針為經過熒光標記的，其5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團；所述報告熒光基團可為FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5等，優選為FAM；所述熒光淬滅基團可為BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse等，優選為BHQ1。

7.根據權利要求5或6所述的專用Taqman探針，其特征在于：當待測目的基因為NDM-1基因時，所述Taqman探針序列如下：

FAM-TF：5’FAM-CATCAGGACAAGATGGGC-BHQ13’（序列表中序列6）；

FAM-TB：5’FAM-TCCAGTTGAGGATCTGGGC-BHQ13’（序列表中序列7）。