[發(fā)明專利]一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310469439.4
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN103484551A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉倫;李雪梅;付金玲;陳剛
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢康錄生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

EGFR（epidermal?growth?factor?receptor）即表皮生長因子受體，正常情況下包埋在細(xì)胞表面的細(xì)胞膜中，是一種對腫瘤細(xì)胞的繁殖、生長、修復(fù)和存活等起重要作用的膜蛋白。

目前臨床上治療癌癥的部分靶向藥物如單抗類藥物（愛必妥Eribtux、西妥昔單抗Cectibix/帕尼單抗Panitumumab）、小分子類藥物（易瑞沙Iressa/吉非替尼Gefitinib、特羅凱Tarceva/尼羅替尼Erlotinib），通過阻斷EGFR的活性抑制其磷酸化和信號傳導(dǎo)，從而起到抗腫瘤作用，同時也能增加化療和放療的抗腫瘤療效。

易瑞沙和特羅凱是近年來開發(fā)的兩種特異性較高的治療非小細(xì)胞肺癌的腫瘤靶向治療藥物，它們都屬于表面生長因子受體（EGFR）-絡(luò)氨酸激酶抑制劑（TKI）類藥物，該類藥物通過抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展中必須的表皮生長因子受體絡(luò)氨酸激酶活性而阻斷腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成并促進腫瘤細(xì)胞的凋亡。

臨床實踐顯示易瑞沙和特羅凱這兩種藥物療效存在很大的個體差異，僅有25%-35%的個體很有很好的效果。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因絡(luò)氨酸激酶區(qū)域存在多種突變，這些突變主要集中在外顯子18～21上，其中以19號外顯子內(nèi)缺失突變以及21號外顯子L858R最為常見，這些突變能夠很好地預(yù)測易瑞沙和特羅凱的治療效果，為腫瘤用藥提供指導(dǎo)依據(jù)。

目前用于基因突變檢測的方法有Sanger測序法、高效液相色譜法、實時熒光定量PCR法等。Sanger基因測序技術(shù)經(jīng)過了30年的不斷發(fā)展與完善，現(xiàn)在已經(jīng)可以對長達1,000bp的DNA片段進行測序，而且對每一個堿基的讀取準(zhǔn)確率高達99.999%。由于具有很高的讀取準(zhǔn)確率，Sanger法測序成為基因突變、單核苷酸多態(tài)性等基因分析的金標(biāo)準(zhǔn)。

腫瘤組織中，EGFR野生型細(xì)胞與突變型細(xì)胞混雜，而Sanger測序法的靈敏度僅為10～20%，即當(dāng)突變型細(xì)胞占整體檢測細(xì)胞的10～20%時才能檢出，因此而極大的限制了Sanger測序法的應(yīng)用。

肽核酸（peptide?nucleic?acids，PNA)一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過計算機設(shè)計構(gòu)建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補DNA具有1個堿基不匹配時，其溶解溫度會下降8℃～20℃，2個堿基不匹配時則完全不能雜交。鑒于上述諸多DNA分子不具備的優(yōu)點，近十年來，人們?yōu)槠湓谠S多高技術(shù)領(lǐng)域找到了用途。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明采用PNA鉗夾技術(shù)封閉野生型EGFR基因序列，從而提高檢測EGFR基因熱點突變的敏感度和突變檢出率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：