[發明專利]一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310469439.4
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN103484551A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 葉倫;李雪梅;付金玲;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

1.一種用于檢測EGFR基因熱點突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應液、PCR引物、探針、PNA試劑、酶消化液、測序反應液、磁珠和產物純化液，所述PCR反應液包含PCR緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶，所述PCR引物包括4對相互獨立的引物，第一對引物的正向引物序列為SEQ.ID?NO.1，反向引物序列為SEQ.ID?NO.2，第二對引物的正向引物為SEQ.ID?NO.3，反向引物為SEQ.ID?NO.4，第三對引物的正向引物為SEQ.ID?NO.5，反向引物為SEQ.ID?NO.6，第四對引物的正向引物為SEQ.ID?NO.7，反向引物為SEQ.ID?NO.8；所述探針包括4組相互獨立的探針，第一組探針的序列為SEQ.ID?NO.9，第二組探針的序列為SEQ.ID?NO.10，第三組探針的序列為SEQ.ID?NO.11，第四組探針的序列為SEQ.ID?NO.12，所述四組探針的5’端的熒光基團均為FAM，3’端的熒光基團均為BHQ1；所述PNA試劑包含五組相互獨立的PNA試劑，第一組PNA試劑中PNA序列為SEQ.ID?NO.13，第二組PNA試劑中PNA序列為SEQ.ID?NO.14，第三組PNA試劑中PNA序列為SEQ.ID?NO.15，第四組PNA試劑中PNA序列為SEQ.ID?NO.16，第五組PNA試劑中PNA序列為SEQ.ID?NO.17；所述測序反應液中含有Bigdye、Bigdye緩沖液和測序引物。

2.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液由100mmol/L?Tris-HCl、500mmol/L?KCl和15mmol/L?MgCl₂組成；所述dNTPs的摩爾濃度為2.5mmol/L?dNTPs；所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/μl；所述4對相互獨立的引物，每對PCR引物中均含有10μmol/L?PCR正向引物和10μmol/L?PCR反向引物；所述4組相互獨立的探針，每組探針的摩爾濃度均為10μmol/L；所述五組相互獨立的PNA試劑，每組PNA試劑中PNA序列的摩爾濃度均為10μmol/L。

3.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ和堿性磷酸酶。

4.根據權利要求3所述試劑盒，其特征在于所述核酸外切酶Ⅰ和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5：2。

5.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述測序反應液含有5×Bigdye、2.5×Bigdye緩沖液和3μmol/L的測序引物。

6.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述產物純化液為0.75M氯化鈉溶液。

7.根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于在所述4對PCR引物的正向引物的5’端均插入通用M13序列：TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述4對PCR引物的反向引物的5’端插入通用M13序列：CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測序引物序列為：TGTAAAACGACGGCCAGT。

8.一種使用權利要求1～7所述試劑盒檢測EGFR基因熱點突變的方法，其特征在于它包括如下步驟：

（1）目的基因熒光定量PCR擴增：使用試劑盒中的PCR反應液、PCR引物、探針和PNA試劑，對樣品DNA進行PCR擴增反應，得到目的基因的熒光定量結果和PCR產物；

（2）根據步驟（1）中的定量結果，使用試劑盒中的酶消化液，對步驟（1）得到的PCR產物進行純化，得到純化后PCR產物；

（3）使用試劑盒中的測序反應液，對步驟（2）得到的純化后PCR產物進行測序PCR反應，得到測序PCR產物；

（4）使用試劑盒中的磁珠和產物純化液，對步驟（3）得到的測序PCR產物進行純化，得到純化后測序PCR產物；

（5）將步驟（4）得到的純化后測序PCR產物加樣至測序儀進行序列分析，測序所得基因序列與EGFR基因標準序列進行比對，并查看峰圖，判斷是否存在EGFR基因熱點突變。