[發(fā)明專利]高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310467876.2
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號(hào): CN103525854A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉作易;曹旸;劉永翔
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州省生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N1/15;C12R1/66
• 代理公司: 貴陽中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

1.一種高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

步驟（1）：以謝瓦氏曲霉間型變種基因組DNA為模板，采用引物P12和P13擴(kuò)增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物P10和P11擴(kuò)增Ku70基因5’端DNA片段U；引物對P12的序列為5’-CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物對P13的序列為5’-TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物P10的序列為5’-CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’；引物P11的序列為5’-CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’；

步驟（2）：XbaⅠ和SacⅠ雙酶切DNA片段D和質(zhì)粒pDHt/sknt，純化后連接得到重組質(zhì)粒pDHt/sknt-D；HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切DNA片段U和質(zhì)粒pDHt/sknt-D，純化后連接得到重組質(zhì)粒pDHt/sknt-D-U，即為ku70基因敲除載體；

步驟（3）：將Ku70基因敲除載體通過凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株；含正確Ku70基因敲除載體的根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上劃線，在28℃下培養(yǎng)48h；挑取根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于含50μg/ml卡那霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在28℃下，220r/min?培養(yǎng)48h；取1-2ml菌液用誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋到吸光度為0.15，然后在28℃下，220?r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD600為0.45-0.50；取100?μl誘導(dǎo)活化的根癌農(nóng)桿菌菌液和100μl?1×10⁶個(gè)/ml的分生孢子液混勻，涂布在共培養(yǎng)培養(yǎng)基平板上，在28℃下共培養(yǎng)48h；將融化的MYA固體培養(yǎng)基，MYA固體培養(yǎng)基含8?μg/ml的G418以及300μg/ml的氨芐青霉素，均勻倒在共培養(yǎng)平板上，在28℃下培養(yǎng)至出現(xiàn)抗性菌落；挑取轉(zhuǎn)化子單菌落轉(zhuǎn)接到含200μg/ml?G418的固體培養(yǎng)基平板上，MYA培養(yǎng)基中NaCl的質(zhì)量百分比為5%，在28℃下培養(yǎng)5天，然后收集轉(zhuǎn)化子菌絲；

步驟（4）：提取G418抗性轉(zhuǎn)化子基因組DNA，用引物P14和P15進(jìn)行PCR驗(yàn)證，引物P14的序列為5’-GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列為5’-GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’；?篩選出PCR產(chǎn)物為2611bp的轉(zhuǎn)化子菌株，初步鑒定為Ku70基因敲除突變菌株；篩選出PCR產(chǎn)物為2611bp的Ku70基因敲除突變菌株；

步驟（5）制備初步鑒定為Ku70基因敲除突變菌株；的分生孢子，進(jìn)行單孢分離；提取單孢分離后菌株的基因組DNA，用引物P14和P15進(jìn)行PCR驗(yàn)證；PCR產(chǎn)物為2611bp的菌株初步鑒定為Ku70基因敲除突變菌株，提取基因組DNA，分別用EcoRⅠ和SacⅠ酶切，然后電泳并進(jìn)行southern?blot驗(yàn)證；采用引物nptF和nptRV，以質(zhì)粒pUR5750為模板，制備southern?blot探針；采用CTAB法提取基因組DNA，分別用EcoRⅠ和SacⅠ酶切酶切基因組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；EcoRⅠ和SacⅠ分別酶切基因組DNA的southern?blot條帶均為一條帶，表明再次鑒定的Ku70基因敲除突變菌株為?Ku70基因敲除突變菌株。