[發明專利]高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法

無效

• 申請號: 201310467876.2
• 申請日: 2013-10-10
• 公開（公告）號: CN103525854A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 劉作易;曹旸;劉永翔
• 申請（專利權）人: 貴州省生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C12R1/66
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

技術領域

本發明涉及一種生物技術，尤其是一種高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法。

背景技術

謝瓦氏曲霉間型變種俗稱“金花”菌，是茯磚茶發花過程中的優勢菌種，其閉囊殼即“金花”數量決定著茯磚茶的品質(彭小赟，趙運林，何小書，雷存喜，劉石泉，周曉梅，董萌，胡志遠?2011)。目前，謝瓦氏曲霉間型變種的命名還存在爭議，這可能是由于取材和鑒定方法的差異造成的(丁婷，呂嘉櫪?2012;?胡治遠，趙運林，劉石泉，李燕子，許永立?2012)，其中1990年劉作易等采用電鏡的方法將“金花”菌鑒定為謝瓦氏曲霉間型變種(劉作易，秦京，王迺亮?1990)。茯磚茶是一種重要的“邊銷茶”，在西南和西北少數民族地區很受歡迎。謝瓦氏曲霉間型變種在茯磚茶上生長使茯磚茶具有一定的保健功能，主要體現在降脂減肥、促進消化、抗腫瘤功能和安全性可靠等方面(鄧放明，龔舒莉，楊偉麗?2007;?黃群，陳林杰，李顏坡，車科?2007;?丁婷，呂嘉櫪，侯蓓?2011;?袁勇?2011)。謝瓦氏曲霉間型變種在低滲條件下培養只產生子囊孢子，在高滲條件下培養只產生分生孢子，是研究絲狀真菌有性繁殖和無性繁殖發生機制的良好材料(劉作易，秦京，李乃亮?1991)。因此，對謝瓦氏曲霉間型變種展開分子生物學研究既具有生產價值有具有理論意義。目前，謝瓦氏曲霉間型變種的分子生物學研究工作主要包括構建了根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系和基因表達的差減文庫以及產孢相關基因的克隆(馬權，劉永翔，劉作易?2011;?王海，譚玉梅，劉永翔，王階平，劉作易?2012;?譚玉梅，王海，劉永翔，劉作易?2013)。謝瓦氏曲霉間型變種有性產孢相關基因功能的研究工作以及全基因組和轉錄組測序工作已經開展。然而，較低的基因敲除效率阻礙了謝瓦氏曲霉間型變種的基因功能的研究工作。

作為外源DNA片段，基因敲除盒是通過DSBs修復機制整合到宿主細胞基因組上的。真核細胞的DSBs修復主要有兩個途徑：同源重組（homologous?recombination，HR）和非同源末端交聯（non-homologous?end?joining，NHEJ）。HR需要同源序列，當基因敲除盒通過HR途徑整合到宿主細胞基因組上時便發生基因敲除。NHEJ不依賴同源序列，基因敲除盒通過NHEJ隨機整合到宿主細胞基因組。一般認為，NHEJ與HR是競爭的，主要體現在Ku蛋白對HR的抑制(Krappmann?2007;?Kass?and?Jasin?2010)。絲狀真菌偏愛NHEJ途徑，因此基因敲除效率較低。為提高HR的頻率，得到較高的基因敲除效率，通常采用阻斷NHEJ途徑的策略，主要是敲除NHEJ途徑的關鍵基因ku70或ku80。

發明內容

本發明的目的是：提供一種高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法，通過本發明獲得的工程菌株的基因敲除效率較高，能減少從大量轉化子中獲得基因敲除突變菌株的篩選工作。

本發明是這樣實現的：高基因敲除效率的謝瓦氏曲霉間型變種工程菌株的構建方法，具體包括以下步驟：

步驟（1）：以謝瓦氏曲霉間型變種基因組DNA為模板，采用引物P12和P13擴增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物P10和P11擴增Ku70基因5’端DNA片段U；引物對P12的序列為5’-CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物對P13的序列為5’-TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物P10的序列為5’-CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’；引物P11的序列為5’-CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’；

步驟（2）：XbaⅠ和SacⅠ雙酶切DNA片段D和質粒pDHt/sknt，純化后連接得到重組質粒pDHt/sknt-D；HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切DNA片段U和質粒pDHt/sknt-D，純化后連接得到重組質粒pDHt/sknt-D-U，即為ku70基因敲除載體；