[發(fā)明專利]人乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的藥物代謝水平評價(jià)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310467763.2
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN103529059A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏遠(yuǎn)峰;劉港幟;戴有金;陳景才
• 申請（專利權(quán)）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號(hào): G01N23/00
• 分類號(hào): G01N23/00
• 代理公司: 上?？剖⒅R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及一種人乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的藥物代謝水平評價(jià)方法。

背景技術(shù)

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物的吸收、分布、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著非常重要的作用。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白按照藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方式，可以分為兩種：藥物攝取蛋白和藥物外排蛋白。人乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)，其BCRP基因位于染色體4q22區(qū)域，編碼有655個(gè)氨基酸，是一種重要的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能將進(jìn)入細(xì)胞中的某些藥物外排出細(xì)胞，降低胞內(nèi)藥物濃度，進(jìn)而產(chǎn)生諸如藥物耐藥性、藥物作用減弱及藥物毒性增強(qiáng)等作用。

狗腎近端小管上皮細(xì)胞(MDCK?II)是連接非常緊密的細(xì)胞系，具有低水平表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，低代謝活性。其許多生理特性均與血腦屏障相似，常用于體外藥物透過血腦屏障的篩選模型。在藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)方面，狗腎近端小管上皮細(xì)胞和結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)之間具有很好的相關(guān)性，且其培養(yǎng)周期短，細(xì)胞不同代次間具有良好均一性，能獲得高表達(dá)人乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等優(yōu)點(diǎn)。因此狗腎近端小管上皮細(xì)胞能很好代替結(jié)腸腺癌細(xì)胞作為腸道細(xì)胞模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的，就是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種人乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的藥物代謝水平評價(jià)方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種人乳腺癌耐藥蛋白介導(dǎo)的藥物代謝水平評價(jià)方法，包括如下步驟：

A、穩(wěn)定表達(dá)人乳腺癌耐藥蛋白的狗腎近端小管上皮細(xì)胞系的建立

A1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

A11、在6孔板里，以100萬細(xì)胞每孔植入狗腎近端小管上皮細(xì)胞，用DMEM／10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)；

A12、取脂質(zhì)體5微升加入到250微升OptiMEM?I低血清培養(yǎng)基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；取2微克人乳腺癌耐藥蛋白克隆質(zhì)粒加入到250微升OptiMEM?I低血清培養(yǎng)基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；將上述兩者溫和混勻，室溫放置30分鐘后加入6孔板中，輕輕混勻；

A13、在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24小時(shí)后，形成轉(zhuǎn)染體細(xì)胞進(jìn)行下一步驟；

A2、克隆篩選

A21、將DMEM/10％胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，將步驟A13所得轉(zhuǎn)染體細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移成1：20、1：40和1：80濃度，加入含有潮霉素200微克／毫升的上述培養(yǎng)基培養(yǎng)；

A22、接下來2周內(nèi)每兩天更換培養(yǎng)基，直到?jīng)]有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞全部死亡后，進(jìn)行克隆挑選，挑選出穩(wěn)定表達(dá)人乳腺癌耐藥蛋白細(xì)胞克隆進(jìn)行下一步驟；

A3、Transwell藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)篩選陽性克隆細(xì)胞

A31、將步驟A22挑選出的細(xì)胞克隆以50萬個(gè)細(xì)胞／孔的密度植入24孔的transwell板中，在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)三天，每天更換培養(yǎng)基；

A32、在緩沖液HBSS中配制20nM人乳腺癌耐藥蛋白的特異性放射性配體[3H]-雌酮磺胺；

A33、在transwell板底部加入600微升HBSS緩沖液，在transwell板頂部加入300微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS緩沖液，在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育一小時(shí)，然后收集30微升transwell板底部的HBSS緩沖液；

A34、在transwell板底部加入600微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS緩沖液，在transwell板頂部加入300微升HBSS緩沖液，在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育一小時(shí)，然后收集30微升transwell板頂部的HBSS緩沖液；

A35、分別測定步驟A33、A34所收集HBSS緩沖液中的[3H]-雌酮磺胺的放射強(qiáng)度，并計(jì)算流出比率，流出比率大于6的細(xì)胞克隆為陽性克隆細(xì)胞；

B、人乳腺癌耐藥蛋白藥物代謝水平評價(jià)平臺(tái)的建立

B1、在24孔transwell板里，每孔植入50萬個(gè)步驟A35所得陽性克隆細(xì)胞，在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱里培養(yǎng)三天，每天更換培養(yǎng)基，并測定跨上皮膜電阻值，及熒光黃的滲透率，達(dá)標(biāo)的transwell板將用于人乳腺癌耐藥蛋白藥物篩選；

B2、在transwell板底部加入600微升含10微摩爾待篩選藥物的HBSS緩沖液，在transwell板頂部加入300微升含20nM[3H]-雌酮磺胺及10uM待篩選藥物的HBSS緩沖液，在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育一小時(shí)，然后收集30微升transwell板底部的HBSS緩沖液；