[發明專利]人乳腺癌耐藥蛋白介導的藥物代謝水平評價方法

有效

• 申請號: 201310467763.2
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN103529059A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 夏遠峰;劉港幟;戴有金;陳景才
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N23/00
• 分類號: G01N23/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種人乳腺癌耐藥蛋白介導的藥物代謝水平評價方法，其特征在于：包括如下步驟：

A、穩定表達人乳腺癌耐藥蛋白的狗腎近端小管上皮細胞系的建立

A1、質粒轉染

A11、在6孔板里，以100萬細胞每孔植入狗腎近端小管上皮細胞，用DMEM／10％胎牛血清的培養基培養24小時；

A12、取脂質體5微升加入到250微升OptiMEM?I低血清培養基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；取2微克人乳腺癌耐藥蛋白克隆質粒加入到250微升OptiMEM?I低血清培養基中，溫和混勻，室溫放置5分鐘；將上述兩者溫和混勻，室溫放置30分鐘后加入6孔板中，輕輕混勻；

A13、在37℃、5％二氧化碳培養箱里培養24小時后，形成轉染體細胞進行下一步驟；

A2、克隆篩選

A21、將DMEM／10％胎牛血清的培養基培養過夜，將步驟A13所得轉染體細胞分別轉移成1：20、1：40和1：80濃度，加入含有潮霉素200微克／毫升的上述培養基培養；

A22、接下來2周內每兩天更換培養基，直到沒有轉染質粒的細胞全部死亡后，進行克隆挑選，挑選出穩定表達人乳腺癌耐藥蛋白細胞克隆進行下一步驟；

A3、Transwell藥物轉運實驗篩選陽性克隆細胞

A31、將步驟A22挑選出的細胞克隆以50萬個細胞／孔的密度植入24孔的transwell板中，在37℃、5％二氧化碳培養箱里培養三天，每天更換培養基；

A32、在緩沖液HBSS中配制20nM人乳腺癌耐藥蛋白的特異性放射性配體[3H]-雌酮磺胺；

A33、在transwell板底部加入600微升HBSS緩沖液，在transwell板頂部加入300微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS緩沖液，在37℃、5％二氧化碳培養箱中孵育一小時，然后收集30微升transwell板底部的HBSS緩沖液；

A34、在transwell板底部加入600微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS緩沖液，在transwell板頂部加入300微升HBSS緩沖液，在37℃、5％二氧化碳培養箱中孵育一小時，然后收集30微升transwell板頂部的HBSS緩沖液；

A35、分別測定步驟A33、A34所收集HBSS緩沖液中的[3H]-雌酮磺胺的放射強度，并計算流出比率，流出比率大于6的細胞克隆為陽性克隆細胞；

B、人乳腺癌耐藥蛋白藥物代謝水平評價平臺的建立

B1、在24孔transwell板里，每孔植入50萬個步驟A35所得陽性克隆細胞，在37℃、5％二氧化碳培養箱里培養三天，每天更換培養基，并測定跨上皮膜電阻值，及熒光黃的滲透率，達標的transwell板將用于人乳腺癌耐藥蛋白藥物篩選；

B2、在transwell板底部加入600微升含10微摩爾待篩選藥物的HBSS緩沖液，在transwell板頂部加入300微升含20nM特異性放射性配體[3H]-雌酮磺胺及10uM待篩選藥物的HBSS緩沖液，在37℃、5％二氧化碳培養箱中孵育一小時，然后收集30微升transwell板底部的HBSS緩沖液；

B3、在transwell板底部加入600微升含20nM特異性放射性配體[3H]-雌酮磺胺及10uM待篩選藥物的HBSS緩沖液，在transwell板頂部加入300微升10uM待篩選藥物HBSS緩沖液，在37℃、5％二氧化碳培養箱中孵育一小時，然后收集30微升transwell板頂部的HBSS緩沖液；

B4、分別測定步驟B2，B3所收集的HBSS緩沖液中的[3H]-雌酮磺胺的放射強度，并計算流出比率，流出比率<2的藥物為能夠被人乳腺癌耐藥蛋白代謝的藥物。

2.根據權利要求1所述的人乳腺癌耐藥蛋白介導的藥物代謝水平評價方法，其特征在于：步驟B1中所述達標的transwell板是指跨上皮膜電阻值大于300Ohms／cm²，熒光黃的滲透率小于0.4％／小時。