[發明專利]一種用于檢測KRAS基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310466108.5
• 申請日: 2013-10-09
• 公開（公告）號: CN103571947A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 葉倫;李雪梅;付金玲;陳剛
• 申請（專利權）人: 武漢康錄生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于檢測KRAS基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法。?

背景技術

RAS基因家族與人類腫瘤相關的基因有三種：HRAS、KRAS和NRAS，分別定位在11、12和1號染色體上。KRAS因編碼21kD的ras蛋白又名p21基因。在RAS基因中，KRAS對人類癌癥影響最大，它好像分子開關：當正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則導致細胞持續生長，并阻止細胞自我毀滅。她參與細胞內的信號傳遞，當KRAS基因突變時，該基因永久活化，不能產生正常的RAS蛋白，使細胞內信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。?

KRAS基因可以是正常狀態（稱為野生型）或異常狀態（突變型）。正常生理情況下，在細胞受到外界刺激后激活生長因子等信號通路時，野生型的K-Ras被活性生長因子等酪氨酸激酶磷酸化后短暫活化，活化后的KRAS可以激活該信號通路中的下游信號蛋白，而后K-ras迅速失活。KRAS激活/失活效應是受控的。突變型K-Ras蛋白導致蛋白功能異常，在無生長因子活化信號刺激下仍處于激活狀態，其功能狀態不可控，導致腫瘤的持續增殖等。?

目前用于基因突變檢測的方法有Sanger測序法、高效液相色譜法、實時熒光定量PCR法等。Sanger基因測序技術經過了30年的不斷發展與完善，現在已經可以對長達1,000bp的DNA片段進行測序，而且對每一個堿基的讀取準確率高達99.999%。由于具有很高的讀取準確率，Sanger法測序成為基因突變、單核苷酸多態性等基因分析的金標準。?

腫瘤組織中，KRAS野生型細胞與突變型細胞混雜，而Sanger測序法的靈敏度僅為10～20%，即當突變型細胞占整體檢測細胞的10～20%時才能檢出，因此而極大的限制了Sanger測序法的應用。?

肽核酸（peptide?nucleic?acids，PNA)一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰?胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠優于DNA/DNA或DNA/RNA，表現在很高的雜交穩定性、優良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA與互補DNA具有1個堿基不匹配時，其溶解溫度會下降8℃～20℃，2個堿基不匹配時則完全不能雜交。鑒于上述諸多DNA分子不具備的優點，近十年來，人們為其在許多高技術領域找到了用途。?

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種用于檢測KRAS基因熱點突變的試劑盒及其檢測方法，本發明采用PNA鉗夾技術封閉野生型BRAF基因序列，從而提高檢測KRAS基因熱點突變的敏感度和突變檢出率。?

為解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：?

一種用于檢測KRAS基因熱點突變的試劑盒，包括PCR反應液、PNA試劑、酶消化液、測序反應液、磁珠和產物純化液，所述PCR反應液包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列為SEQ.ID?NO.1，所述PCR反向引物的序列為SEQ.ID?NO.2，所述探針的序列為SEQ.ID?NO.3，所述探針的5’端的熒光基團為FAM，3’端的熒光基團為BHQ1；所述PNA的序列為SEQ.ID?NO.4；所述測序反應液中含有Bigdye、Bigdye緩沖液和測序引物。?

上述方案中，所述PCR緩沖液由100mmol/L?Tris-HCl、500mmol/L?KCl和15mmol/L?MgCl₂組成；所述dNTPs的摩爾濃度為2.5mmol/L?dNTPs；所述PCR正向引物的摩爾濃度為10μmol/L，所述PCR反向引物的摩爾濃度為10μmol/L；所述探針的摩爾濃度為10μmol/L；所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/μl；所述PNA試劑的摩爾濃度為10μmol/L。?

上述方案中，所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ和堿性磷酸酶。?