[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310466108.5
• 申請(qǐng)日: 2013-10-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103571947A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉倫;李雪梅;付金玲;陳剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢康錄生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 鄔麗明

1.一種用于檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應(yīng)液、PNA試劑、酶消化液、測(cè)序反應(yīng)液、磁珠和產(chǎn)物純化液，所述PCR反應(yīng)液包含PCR緩沖液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探針和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列為SEQ.ID?NO.1，所述PCR反向引物的序列為SEQ.ID?NO.2，所述探針的序列為SEQ.ID?NO.3，所述探針的5’端的熒光基團(tuán)為FAM，3’端的熒光基團(tuán)為BHQ1；所述PNA的序列為SEQ.ID?NO.4；所述測(cè)序反應(yīng)液包含Bigdye、Bigdye緩沖液和測(cè)序引物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液由100mmol/LTris-HCl、500mmol/L?KCl和15mmol/L?MgCl₂組成；所述dNTPs的摩爾濃度為2.5mmol/L?dNTPs；所述PCR正向引物的摩爾濃度為10μmol/L，所述PCR反向引物的摩爾濃度為10μmol/L；所述探針的摩爾濃度為10μmol/L；所述DNA聚合酶的酶活力單位濃度為5U/μl；所述PNA試劑的摩爾濃度為10μmol/L。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ和堿性磷酸酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于所述核酸外切酶Ⅰ和堿性磷酸酶的酶活力單位比為5：2。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述測(cè)序反應(yīng)液含有5×Bigdye、2.5×Bigdye緩沖液和3μmol/L的測(cè)序引物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述產(chǎn)物純化液為0.75M氯化鈉溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于在所述PCR正向引物的5’端

插入通用M13序列：TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’端插入通用M13序列：CAGGAAACAGCTATGACC，則所述的測(cè)序引物序列為：TGTAAAACGACGGCCAGT。

8.一種使用權(quán)利要求1～7所述試劑盒檢測(cè)KRAS基因熱點(diǎn)突變的方法，其特征在于它包括如下步驟：

（1）目的基因熒光定量PCR擴(kuò)增：使用試劑盒中的PCR反應(yīng)液和PNA試劑，對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到目的基因的熒光定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；

（2）根據(jù)步驟（1）中的定量結(jié)果，使用試劑盒中的酶消化液，對(duì)步驟（1）得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后PCR產(chǎn)物；

（3）使用試劑盒中的測(cè)序反應(yīng)液，對(duì)步驟（2）得到的純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，得到測(cè)序PCR產(chǎn)物；

（4）使用試劑盒中的磁珠和產(chǎn)物純化液，對(duì)步驟（3）得到的測(cè)序PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化后測(cè)序PCR產(chǎn)物；

（5）將步驟（4）得到的純化后測(cè)序PCR產(chǎn)物加樣至測(cè)序儀進(jìn)行序列分析，測(cè)序所得基因序列與KRAS基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，并查看峰圖，判斷是否存在KRAS基因熱點(diǎn)突變。