[發(fā)明專利]N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310465011.2
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103589695A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 李榮杰;徐斌;汪本助
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N1/21;C12N15/70;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程及微生物發(fā)酵領域，具體地說，涉及一種N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體及其應用。

背景技術

近年來發(fā)現(xiàn)氨基糖類通常作為復雜寡聚糖和多糖類中的單體殘基。氨基葡萄糖是單糖葡萄糖的氨基衍生物。N-乙酰氨基葡萄糖是葡糖胺的乙酰衍生物。葡糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和其他氨基糖類是許多天然多糖的重要組成部分。

將氨基葡糖制成營養(yǎng)藥品用于治療動物和人的骨關節(jié)病等疾病。N-乙酰氨基葡萄糖也是治療多種疾病的有價值的藥物活性劑。由于N-乙酰氨基葡萄糖是動物體內蛋白合成的有價值和重要的成分，因此它對組織再生具有積極的影響，N-乙酰葡萄糖在預防和治療各種疾病方面具有治療潛能，諸如胃炎、食物過敏、炎癥性腸病（IBD）、憩室炎、急性和慢性形式的類風濕性關節(jié)炎和骨關節(jié)炎，以及因骨關節(jié)組織代謝疾病導致的病理情況。

由于工業(yè)生產的氨基葡萄糖不能適宜于所有的人，來源于有殼的水生動物的氨基葡萄糖，對海鮮過敏的人群是不適宜的，越來越多的消費者尋找不含有動物副產物的物質，N-乙酰氨基葡萄糖沒有任何已經(jīng)確定的副作用。通過發(fā)酵生產獲得氨基葡萄糖的過程中，氨基葡萄糖的積累對微生物代謝是有害的，因此只有通過發(fā)酵生產N-乙酰氨基葡萄糖，再對其進行水解即可獲得氨基葡萄糖。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體及其應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

與野生型的N-乙酰葡糖胺轉移酶相比，本發(fā)明的N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體發(fā)生改變的氨基酸序列為：F38S（第38位苯丙氨酸變?yōu)榻z氨酸），P64T（第64位脯氨酸變?yōu)樘K氨酸），I131N（第131位異亮氨酸變?yōu)樘於０罚?/p>

本發(fā)明還提供編碼所述N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體的基因，其核苷酸序列為：

i）Seq?ID?No.2所示的核苷酸序列；或

ii）Seq?ID?No.2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列；或

iii）在嚴格條件下與Seq?ID?No.2所示序列雜交的核苷酸序列；

所述嚴格條件為在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

本發(fā)明還提供含有編碼所述N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體基因的載體、工程菌及轉基因細胞系。優(yōu)選地，所述工程菌的出發(fā)菌株為大腸桿菌。

本發(fā)明還提供所述N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體在N-乙酰氨基葡萄糖合成中的應用。

本發(fā)明進一步提供一種利用大腸桿菌發(fā)酵生產N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通過在大腸桿菌中過表達編碼所述N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體的基因，從而提高N-乙酰氨基葡萄糖的發(fā)酵產量。

所述N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體的篩選方法，包括以下步驟：

（1）由釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）S288C，擴增N-乙酰葡糖胺轉移酶（GNA1）的編碼基因gna1；

（2）采用易錯PCR技術，以基因gna1為模板，擴增獲得GNA1突變體基因；

（3）將步驟（2）所得易錯PCR產物及表達質粒pET28b用BamH?Ⅰ和Xho?Ⅰ雙酶切后連接，連接產物轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布至LB（Kan）平板，即得構建好的重組GNA1基因突變庫；

（4）將LB（Kan）平板上長出的菌落一一對應轉入LB（Kan）液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床培養(yǎng)，待OD₆₀₀值達到0.6-0.8時，加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，37℃繼續(xù)培養(yǎng)12h，然后分別離心收集菌體，破碎，測定GNA1酶活力，挑選酶活力最強的一株，并測定其基因序列，結果SEQ?ID?NO.2所示。

其中，所述野生型N-乙酰葡糖胺轉移酶具有SEQ?ID?NO.3所示的基因序列和SEQ?ID?NO.4所示的氨基酸序列。

本發(fā)明的另一方面提供所述N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體的制備方法，包括以下步驟：

1）PCR擴增編碼所述N-乙酰葡糖胺轉移酶突變體的基因；

2）將步驟1）所得PCR產物連接表達載體pET-28b；

3）連接產物轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞，獲得表達產物；