[發明專利]一種能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201310463629.5
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525789A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 王佳堃;杜文;劉建新
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;A23K1/165
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 林君勇

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶及其制備方法。

背景技術

木聚糖是植物細胞壁中常見的半纖維素多糖，占植物碳水化合物總量的1/3，含量僅次于纖維素，是自然界中第二豐富的可利用資源。在養殖生產中，由于單胃動物缺少降解半纖維素的酶，因此木聚糖對單胃動物幾乎沒有營養作用，而且沒有消化的纖維物質會增加食物的黏性，干擾消化酶的作用及營養的吸收；反芻動物由于瘤胃微生物的存在，對木聚糖具有一定的降解能力，但是，實際生產中仍需要補充外源酶制劑，進一步提高動物對粗飼料的消化效率。木聚糖酶是能專一水解木聚糖為低聚木糖和D-木糖的一類糖苷水解酶的總稱，由于其在天然材料中表達水平低、生產周期長、酶蛋白提取純化過程繁瑣且成本高，嚴重限制了它的推廣應用。為了滿足飼用木聚糖酶的生產需要、開發半纖維類生物能源，利用基因工程技術生產全細胞木聚糖酶具有重要意義。

酵母表面展示技術是一種固定化的表達異源蛋白質的真核蛋白表達系統，其原理是將外源蛋白基因與載體連接后導入酵母細胞，通過誘導表達，信號肽引導融合蛋白向細胞外分泌。由于融合蛋白含有錨定酵母細胞壁的結構，可將融合蛋白錨定在酵母細胞壁上，從而實現外源蛋白分子固定化表達在酵母細胞表面。酵母生長快、易于培養，展示蛋白在細胞表面穩定且能維持生物活性，加之酵母細胞具有生物安全性，活力強，轉入基因在傳代細胞中能穩定表達。因此，利用酵母表面展示技術，將木聚糖酶基因導入酵母細胞，經過誘導表達，該木聚糖酶通過二硫鍵錨定在酵母表面，使重組酵母細胞具有木聚糖酶的催化活性，將這種具有木聚糖酶活性的酵母細胞冷凍干燥，制成干粉，即可得到全細胞木聚糖酶（見圖1）。由于固定化的酶無需提取純化，對降低生產成本有十分重要的作用，加之本方法所用釀酒酵母本身就是一種安全、綠色的高蛋白單細胞食品級微生物，將這種全細胞木聚糖酶添加到動物飼糧中，不僅能增加動物的營養攝入，還能提高動物對纖維物質的利用效率。

發明內容

本發明提供一種能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶，其添加到動物飼糧中，不僅能增加動物的營養攝入，還能提高動物對纖維物質的利用效率。

本發明還提供一種所述能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶的制備方法，該方法可以顯著簡化酵母轉化的步驟，縮短反應時間，提高制備全細胞木聚糖酶的效率。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶，利用基因克隆和酵母表面展示技術將一段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文庫的木聚糖酶編碼基因ORF6-UN展示到釀酒酵母表面上，誘導表達后，離心回收細胞沉淀，經冷凍干燥后得到細胞干粉，該干粉即為瘤胃源全細胞木聚糖酶；木聚糖酶編碼基因ORF6-UN的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。由于全細胞木聚糖酶是一種固定化的酶，無需提取純化，簡化了生產步驟，對降低生產成本有十分重要的作用。此外，本方法所用釀酒酵母本身就是一種食品級的高蛋白單細胞微生物，因此得到的全細胞木聚糖酶可作為飼料添加劑補充到動物日糧中，將這種瘤胃源全細胞木聚糖酶添加到動物飼糧中，不僅能增加動物的營養攝入，還能提高動物對纖維物質的利用效率。

一種所述的能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶的制備方法，該方法包括如下步驟：

a、重組質粒pYD1/ORF6-UN的構建，包含PCR擴增目的基因、目的基因和質粒pYD1的雙酶切、連接、轉化大腸桿菌、陽性克隆鑒定等步驟；

b、釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）EBY100細胞感受態的制備、外源質粒的轉化；采用的是PEG/LiAc法進行酵母轉化，利用營養缺陷型培養基進行篩選；

c、釀酒酵母陽性克隆鑒定，采用酵母菌液PCR的方式進行陽性克隆鑒定，模板制備采取的是反復凍融的方法；

d、重組釀酒酵母細胞EBY100-pYD1/ORF6-UN的誘導表達。先用含2%葡萄糖（glucose）的無氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物（YNB-CAA）培養基進行培養24-48h，至OD600的在2-5之間時，離心15min，棄上清，用含2%半乳糖（galactose）的無氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物（YNB-CAA）培養基懸浮細胞進行誘導表達。

作為優選，步驟a、重組質粒pYD1/ORF6-UN的構建過程具體如下：

①PCR擴增木聚糖酶編碼基因ORF6-UN；

②用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切目的片段和穿梭質粒pYD1；

③構成重組質粒轉化大腸桿菌（E.coli）Trans10感受態細胞；