[發明專利]一種能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201310463629.5
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103525789A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 王佳堃;杜文;劉建新
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;A23K1/165
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 林君勇

1.一種能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶，其特征在于：利用基因克隆和酵母表面展示技術將一段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文庫的木聚糖酶編碼基因ORF6-UN展示到釀酒酵母表面上，誘導表達后，離心回收細胞沉淀，經冷凍干燥后得到細胞干粉，該干粉即為瘤胃源全細胞木聚糖酶；木聚糖酶編碼基因ORF6-UN的核苷酸序列如SEQ?ID?No.?1所示。

2.一種權利要求1所述的能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

a、重組質粒pYD1/ORF6-UN的構建，?

b、釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）EBY100細胞感受態的制備、外源質粒的轉化，?

c、釀酒酵母陽性克隆鑒定，?

d、重組釀酒酵母細胞EBY100-pYD1/ORF6-UN的誘導表達。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟a、重組質粒pYD1/ORF6-UN的構建過程具體如下：

①PCR擴增木聚糖酶編碼基因ORF6-UN；

②用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切目的片段和穿梭質粒pYD1；

③構成重組質粒轉化大腸桿菌（E.coli）Trans?10感受態細胞；

④鑒定陽性克隆，將陽性克隆單菌落接入LB培養基中擴大培養，抽提質粒pYD1/ORF6-UN。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟①中，PCR擴增采用的特異性引物為

上游引物ORF6-?BamHⅠ：5′-TGACGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3′??SEQ?ID?No.2，

和下游引物ORF6-?XhoⅠ：

5′-CACCTCGAGCGCCCCCTCGATATAGACCT-3′???SEQ?ID?No.3。

5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟d、重組釀酒酵母細胞EBY100-pYD1/ORF6-UN的誘導表達過程具體如下：

①采用添加了2%半乳糖的無氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物（YNB-CAA）培養基進行誘導表達；

②培養48?h后離心取細胞沉淀，經冷凍干燥后得到細胞干粉，該干粉即為瘤胃源全細胞木聚糖酶。

6.一種權利要求1所述的能促進瘤胃發酵的全細胞木聚糖酶在提高反芻動物對粗飼料的利用率方面的應用，其特征在于：所述的全細胞木聚糖酶按照粗飼料重量的1.5-2.0%進行飼喂。