[發明專利]檢測H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒

無效

• 申請號: 201310462250.2
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103571971A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 馮淑萍;顏健華;熊毅;梁丹潔;李春英;孫翔翔
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

技術領域

本發明屬于動物病毒分子生物檢測技術領域，具體涉及檢測H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒。?

背景技術

H1Nl亞型豬流感病毒(Swine?influenza?virus，SIV)是豬流感(Swine?influenza，SI)的重要病原之一，為正粘病毒科、A型流感病毒屬，由8個分節段的基因組構成，共編碼10-11種蛋白。HINl亞型豬流感1918年美國最先報道，Shope于1930年第一次分離鑒定該亞型病毒，這也是首次確診豬流感病毒，此后不斷傳播，現已在五大洲都發現其蹤跡。該病毒可感染豬，引起豬發生急性、熱性呼吸器官傳染病，主要以突發的呼吸系統并轉歸迅速的綜合癥狀為特征，是豬呼吸道綜合征癥候群疾病之一。由于豬流感病毒對呼吸道上皮細胞具有親嗜特性，可對其造成損傷，在臨床上豬群的發病率可高達100％，病死率1％～4％，如伴隨其他呼吸系統疾病的繼發、混合感染，會導致豬群的損傷程度和病死率會大幅度增高。目前，從豬體中分離到流感病毒有H1N1、H1N2、H3N2、H1N7、H4N6、H3N6、H5N1和H9N2等多個亞型的病毒，能引起豬流感癥狀并在當今豬群中傳播主要有3個亞型，H1N1、H3N2和H1N2，而H1N1在豬流感病毒中占優勢地位，近些年世界各地分離到的豬流感病毒亞型大部分都是H1Nl。Sreta等研究發現H1N1致病力較其它豬流感病毒更強，感染斷奶乳豬仔豬的肺損傷度比H3N2的嚴重，極大危害豬群的健康。值得注意的是，已有報道美國于2005年12月至2009年2月出現的10例H1N1亞型和1例是H1N2豬流感病毒感染人病例，其中證實9例與豬有直接接觸史，2009年3月始發于墨西哥的21世紀甲型H1N1流感大流行，令此亞型流感病毒愈加受到高度的重視。?

H1N1豬流感根據病毒基因片段來源不同，可分為古典型H1N1豬流感、類禽型H1Nl豬流感和類人型H1Nl豬流感。三類H1N1豬流感病毒在世界各地處于不同階段的流行情況各不相同。因此建立有效的診斷方法對防治H1Nl亞型豬流感具有重要意義。?

發明內容

本發明的目的是提供檢測H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒，具有較高的靈敏度和特異性，且檢測成本低，有良好的應用前景。?

本發明的技術方案為：?

檢測H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物，所述引物為兩對：針對H1基因的引物和針對N1?基因的引物，所述針對H1基因引物的上游引物ɑHu核苷酸序列為5’-GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列為5’-ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，針對N1基因引物的上游引物Nu核苷酸序列為5’-TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’，下游引物Nd核苷酸序列為5’-GACCAAGCGACTGACTCAA-3’。?

一種檢測H1N1豬流感病毒的試劑盒,所述試劑盒包括以上所述的引物。?

以上所述檢測H1N1豬流感病毒的試劑盒,所述試劑盒還包括：RNA提取試劑、RT反應試劑、PCR反應試劑、陰性對照和陽性對照。?

所述RNA提取試劑包括：Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇；?

所述RT反應試劑包括：5×buffer緩沖液、dNTPs、HIR、Uni12；?

所述PCR反應試劑包括：Taq?DNA酶、10×buffer緩沖液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；?

所述陰性對照包括：DEPC水；?

所述陽性對照包括：古典型H1N1豬流感病毒、類禽型H1Nl豬流感病毒和類人型H1Nl豬流感病毒。?

所述古典型H1N1豬流感病毒可為古典型H1N1豬流感毒株，如：廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心實驗室分離保存的古典型H1N1豬流感毒株；所述類禽型H1Nl豬流感病毒可為類禽型H1Nl豬流感毒株，如：廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心實驗室分離保存的類禽型H1Nl豬流感毒株；所述類人型H1Nl豬流感病毒可為類人型H1Nl豬流感毒株，如：廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心實驗室分離保存的類人型H1Nl豬流感毒株。?

本發明的具體原理是利用H1N1豬流感病毒的同源性，應用OLIG6.0軟件，合成針對H1基因和N1基因的兩對靶核苷酸序列的特異性引物，用RT-PCR方法擴增出特異性的目的帶。試驗方法及過程如下：?

1.引物設計：?