[發明專利]檢測H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物及試劑盒

無效

• 申請號: 201310462250.2
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103571971A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 馮淑萍;顏健華;熊毅;梁丹潔;李春英;孫翔翔
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

1.檢測H1N1豬流感病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物為兩對：針對H1基因的引物和針對N1基因的引物，所述針對H1基因引物的上游引物ɑHu核苷酸序列為5’-GGAATGGTAGATGGATGGT-3’，下游引物Hd核苷酸序列為?5’-ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’，針對N1基因引物的上游引物Nu核苷酸序列為5’-TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’，下游引物Nd核苷酸序列為?5’-GACCAAGCGACTGACTCAA-3’。

2.一種檢測H1N1豬流感病毒的試劑盒,?其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物。

3.根據權利要求2所述檢測H1N1豬流感病毒的試劑盒,?其特征在于，所述試劑盒還包括：RNA提取試劑、RT反應試劑、PCR反應試劑、陰性對照和陽性對照。

4.根據權利要求3所述檢測H1N1豬流感病毒的試劑盒,?其特征在于：

（1）所述RNA提取試劑包括：Trizol裂解液、氯仿、異丙醇和75%的DEPC乙醇；

（2）所述RT反應試劑包括：5×buffer緩沖液、dNTPs、HIR、Uni?12；

（3）所述PCR反應試劑包括：Taq?DNA酶、10×buffer緩沖液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；

（4）所述陰性對照包括：DEPC水；

（5）所述陽性對照包括：古典型H1N1豬流感病毒、類禽型H1Nl豬流感病毒和類人型H1Nl豬流感病毒。

5.根據權利要求4所述檢測H1N1豬流感病毒的試劑盒,?其特征在于，所述古典型H1N1豬流感病毒為古典型H1N1豬流感毒株，所述類禽型H1Nl豬流感病毒為類禽型H1Nl豬流感毒株，所述類人型H1Nl豬流感病毒為類人型H1Nl豬流感毒株。

6.一種如權利要求4或5所述檢測H1N1豬流感病毒試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

（1）病毒RNA的提?。??

取待檢樣品、陽性對照、陰性對照各500μL于1.5ml滅菌無RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液進行裂解，充分振蕩，室溫放置10分鐘；加入300μL氯仿，搖勻放置10分鐘；低溫高速離心機12000轉/分鐘離心15分鐘；緩慢取出上層液體600μL放置于新的EP管；加入等量異丙醇輕輕混勻，-20℃放置30分鐘；低溫高速離心機12000轉/分鐘離心15分鐘，棄去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管內洗滌沉淀，充分吸棄洗滌；將EP管倒置于吸水紙上，盡量吸干液體，放置于37℃溫箱中15分鐘，管內無可見水珠時取出；加入25μL?DEPC水，-20℃保存備用；

（2）RT操作程序：??

取5×buffer緩沖液5μL、dNTPs?2μL、M-MLV?0.5μL、HIR?0.5μL、Uni?12?2μL，RNA?15μL，?將上述液體置于同一EP管內，混勻后放于PCR儀按如下程序操作：42?℃?60?min，95?℃?5?min；

（3）PCR操作程序：

上游引物ɑHu、Nu各0.4μL、下游引物Hd、Nd各?0.4μL，Taq?DNA酶0.2μL、10×buffer緩沖液2.5μL、dNTPs?2μL、MgCl₂2μL、DEPC水11.7μL,?cDNA?5μL，將上述液體置于同一EP管內，混勻后放于PCR儀按如下程序操作,擴增條件：94?℃?30s，56?℃?30?s，72?℃?30?s，35?個循環。