[發明專利]粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法

有效

• 申請號: 201310462072.3
• 申請日: 2013-09-30
• 公開（公告）號: CN103497928A
• 公開（公告）日: 2014-01-08
• 發明（設計）人: 王軍輝;張建偉;張守攻
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院林業研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及林業中細胞工程種苗繁殖領域，具體地，涉及一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法。

背景技術

植物體細胞胚胎發生技術，是指在離體條件下，已分化的體細胞在特定的環境條件下，發育成與合子胚類似的胚狀體的過程。植物體細胞胚胎發生是利用細胞工程手段實現植株再生的重要途徑之一，作為一種利用人工手段能夠最大限度地實現植物擴繁的措施，尤其對于難以扦插繁殖且繁殖周期較長的針葉樹樹種來說具有巨大的應用價值。同時，由于體細胞胚和合子胚具有相似的形態結構和發育過程，體細胞胚胎發生過程又具有相對的遺傳穩定性；開展植物體細胞胚胎發生的研究，已經為揭示植物胚胎的發生機理研究和開展遺傳轉化研究提供了一種模式研究系統。

一個完整的植物體細胞胚胎發生技術包括胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織的增殖、體細胞胚的分化和成熟體細胞胚的萌發等四個階段；其中，成熟體細胞胚的萌發階段作為整個技術體系的最后一步，體細胞胚萌發率的高低及萌發質量，直接決定著最終體胚苗的收獲量和整個體胚技術體系構建的成敗。目前，在針葉樹樹種體細胞胚萌發階段，為提高體細胞胚的萌發率和萌發質量，國外常用的方法是將體細胞胚萌發之前進行干化（Desiccation）預處理。通常，失水現象是體細胞胚由成熟階段向萌發階段轉變的最直接響應，可以促使體細胞胚由形態成熟向萌發所需的生理成熟轉變；因此，對體細胞胚而言，給予適當的干化失水處理，不僅能夠抑制分化培養基中體細胞胚的提早萌發，還能夠提高體細胞胚在萌發階段中的萌發數量和質量。

一般根據體細胞胚失水速率的變化，可以將體細胞胚的干化處理方法分為完全干化（Full?Desiccation）和部分干化（Partial?Desiccation）兩種；前者主要由滲透壓調節物質實現，而后者主要通過水蒸氣變化調節。盡管干化處理能夠提高萌發頻率，然而影響干化處理效果的因素有很多：干化方法的差異、干化處理持續的時間、樹種的不同、甚至相同樹種不同基因型之間對相同干化處理方法的響應都存在很大差異。如果不考慮影響干化處理效果的因素，采用單一的干化處理條件，肯定不能夠滿足所有基因型或者細胞系體細胞胚的萌發需要。因此，國外有學者甚至提出，每一個細胞系都可能對應一個獨一無二的干化處理方案，若想建立合適的干化處理方案，需要對每個細胞系的體細胞胚干化條件逐一探索。這種逐一探索的方法費時費力，在實際生產中可行性較差。

粗枝云杉（Picea?asperata?Mast）為松科，云杉屬樹種，國內俗稱云杉，為我國特有種，也是我國分布最廣的云杉屬樹種。常綠喬木，高達45m，胸徑達1m。主要分布于川西高原、甘肅東南部和陜西西南部的亞高山地區，平均海拔分布在2400～3600m的高山丘陵地帶。木材黃白色，較輕軟，紋理直，結構細，有彈性。是重要的造紙、建筑、家具及木纖維工業的原材料。材質優良，生長快，適應性強，是分布區的主要造林樹種。目前，人工造林用苗主要通過實生繁殖，但粗枝云杉結實晚，種子成熟率低，且伴有嚴重的“大小年”現象，致使粗枝云杉優良種苗供不應求。

在過去幾年，本申請的發明人嘗試首次構建粗枝云杉體細胞胚胎發生技術體系。在此過程中，胚性愈傷組織的誘導、胚性愈傷組織的增殖、體細胞胚的分化等階段的技術體系已經非常成熟，并符合生產需要。然而，在體細胞胚的萌發過程中，盡管經過大量的探索工作，對影響體細胞胚萌發的因素做了盡可能多的嘗試，篩選出的萌發條件雖能顯著地提高粗枝云杉體細胞胚的萌發率，但是萌發率還是不夠高（平均為20%左右），仍然不能盡可能高地滿足實際生產的需要。

因此，若能在粗枝云杉體細胞胚萌發之前，確定其合適的干化處理方法，可以極顯著地提高體細胞胚的萌發率和明顯提高體細胞胚萌發的質量；并且該處理方法如果不會受到基因型和細胞系的影響，具有普遍的適用性，將為實現粗枝云杉體細胞胚的工廠化育苗，提供了巨大的應用前景。

發明內容

為了解決現有技術中的問題，本發明的目的是提供一種粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法。

為了實現上述目的，本發明提供的粗枝云杉體細胞胚萌發前的干化處理方法，包括：在獲得粗枝云杉的體細胞胚后，對體細胞胚采用“濾紙橋法”、“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理0～21天，然后再進行萌發。

本發明所述的方法，優選對體細胞胚采用“空培養容器法”或“濾紙法”的方式進行干化處理。

本發明所述的方法，更優選對體細胞胚采用“濾紙法”的方式進行干化處理。